大黃魚(yú)Rac基因cDNA全長(zhǎng)克隆及分析ppt課件

1、大黃魚(yú)大黃魚(yú)Rac基因基因cDNA全全長(zhǎng)克隆及分析長(zhǎng)克隆及分析 主要內(nèi)容主要內(nèi)容v研討背景與意義研討背景與意義v技術(shù)道路技術(shù)道路v結(jié)果與分析結(jié)果與分析v結(jié)論結(jié)論v致謝語(yǔ)致謝語(yǔ)研討背景與意義研討背景與意義v大黃魚(yú)屬于硬骨魚(yú)綱鱸形目石首魚(yú)科黃魚(yú)屬大黃魚(yú)屬于硬骨魚(yú)綱鱸形目石首魚(yú)科黃魚(yú)屬, ,又名黃又名黃花魚(yú)、黃瓜魚(yú)、大黃花魚(yú)，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種，花魚(yú)、黃瓜魚(yú)、大黃花魚(yú)，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種，也是福建省的主要養(yǎng)殖種類。也是福建省的主要養(yǎng)殖種類。 隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)展、世代添加，病害問(wèn)題越來(lái)越趨隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)展、世代添加，病害問(wèn)題越來(lái)越趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)呵斥了宏大的經(jīng)濟(jì)損失，妨礙了大嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)呵斥了宏大

2、的經(jīng)濟(jì)損失，妨礙了大黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的繼續(xù)開(kāi)展。因此，從其本身的抗病力黃魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的繼續(xù)開(kāi)展。因此，從其本身的抗病力入手，提高魚(yú)體本身的免疫力來(lái)抵抗病原微生物的入手，提高魚(yú)體本身的免疫力來(lái)抵抗病原微生物的侵襲是一個(gè)很好的途徑。侵襲是一個(gè)很好的途徑。 1、Rac蛋白是小分子蛋白是小分子GTP結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白R(shí)as超超家族中最大的亞家族。家族中最大的亞家族。2、Rac在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揚(yáng)著調(diào)理作用。在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揚(yáng)著調(diào)理作用。3、近來(lái)發(fā)現(xiàn)、近來(lái)發(fā)現(xiàn), Rac與細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)，與細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)，是一種免疫相關(guān)因子，本實(shí)驗(yàn)期望克隆大是一種免疫相關(guān)因子，本實(shí)驗(yàn)期望克隆大黃魚(yú)黃魚(yú)Rac基因序列，為以后進(jìn)一步研

3、討與基因序列，為以后進(jìn)一步研討與分析奠定根底。分析奠定根底。技術(shù)道路技術(shù)道路拼接拼接cDNAcDNA全長(zhǎng)全長(zhǎng)分析分析提取肌肉組織總提取肌肉組織總RNARNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA保守區(qū)擴(kuò)增保守區(qū)擴(kuò)增3 3RACERACE擴(kuò)增擴(kuò)增5 5RACERACE擴(kuò)增擴(kuò)增分析查找序列分析查找序列設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物結(jié)果及分析結(jié)果及分析1 1、肌肉總、肌肉總RNARNA的提取結(jié)果的提取結(jié)果 圖圖1 1.5%1 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大黃魚(yú)肌肉總瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大黃魚(yú)肌肉總RNARNARNARNA條帶明晰，闡明條帶明晰，闡明RNARNA無(wú)明顯降解，無(wú)明顯降解，可用于逆轉(zhuǎn)錄可用于逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA

4、。在在200-300bp200-300bp之間有之間有一條明顯條帶而陰一條明顯條帶而陰性對(duì)照未擴(kuò)增出條性對(duì)照未擴(kuò)增出條帶，證明反轉(zhuǎn)錄反帶，證明反轉(zhuǎn)錄反響勝利，響勝利，cDNAcDNA模板模板可用?？捎谩?、cDNA模板檢測(cè)結(jié)果模板檢測(cè)結(jié)果圖圖2 2 經(jīng)過(guò)擴(kuò)增經(jīng)過(guò)擴(kuò)增-actin-actin基因檢測(cè)基因檢測(cè)cDNAcDNA M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：特異性擴(kuò)增；：特異性擴(kuò)增； 2 2：以水做模板的陰性對(duì)照：以水做模板的陰性對(duì)照M 1 2圖圖3 3 凝膠電泳檢測(cè)保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以

5、水作為模板的陰性對(duì)照；：以水作為模板的陰性對(duì)照； 2 2：特異性擴(kuò)增：特異性擴(kuò)增可看到一條約可看到一條約530bp530bp的條帶，的條帶，條帶較明晰，條帶較明晰，而陰性對(duì)照無(wú)而陰性對(duì)照無(wú)條帶。闡明擴(kuò)條帶。闡明擴(kuò)增得到的條帶增得到的條帶能夠就是所需能夠就是所需條帶，將瓊脂條帶，將瓊脂糖塊回收做后糖塊回收做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3 3、保守區(qū)擴(kuò)增結(jié)果、保守區(qū)擴(kuò)增結(jié)果 M 1 2 產(chǎn)物回收產(chǎn)物回收 產(chǎn)物與載產(chǎn)物與載體的銜接體的銜接 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 初篩重組初篩重組子子 圖圖4 4 凝膠電泳檢測(cè)菌落凝膠電泳檢測(cè)菌落PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以水作為模板

6、的陰性對(duì)照；：以水作為模板的陰性對(duì)照； 2:2:以以PCRPCR產(chǎn)物為模板的陽(yáng)性對(duì)照；產(chǎn)物為模板的陽(yáng)性對(duì)照； 3-63-6：菌落：菌落PCRPCR4 4、PCRPCR挑選克隆子結(jié)果挑選克隆子結(jié)果M 1 2 3 4 5 6 隨機(jī)挑隨機(jī)挑4 4個(gè)個(gè)克隆子均克隆子均含有約含有約530bp530bp的的目的條帶，目的條帶，都為陽(yáng)性都為陽(yáng)性克隆克隆 5、 3RACE第一輪第一輪PCR結(jié)果結(jié)果 圖圖6 6 凝膠電泳檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)3RACE3RACE第一輪反響產(chǎn)物第一輪反響產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第一輪反響產(chǎn)物；：第一輪反響產(chǎn)物； 第一輪擴(kuò)增得到一條第一輪擴(kuò)增得到

7、一條較亮的較亮的1100bp1100bp左右的左右的條帶，陰性對(duì)照無(wú)條條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶帶. .6、3RACE第二輪第二輪PCR 圖圖7 7 凝膠電泳檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)3RACE3RACE第二輪反響產(chǎn)物第二輪反響產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第二輪產(chǎn)物：第二輪產(chǎn)物第二輪擴(kuò)增得到一條大小第二輪擴(kuò)增得到一條大小介于介于250-500bp250-500bp之間的條帶，之間的條帶，與目的條帶預(yù)期大小根本與目的條帶預(yù)期大小根本相符，陰性對(duì)照無(wú)條帶，相符，陰性對(duì)照無(wú)條帶，闡明該片段能夠就是所需闡明該片段能夠就是所需片段，將瓊脂糖塊回收做片段，將瓊脂糖塊回收做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后

8、續(xù)實(shí)驗(yàn)。 7、3RACE克隆產(chǎn)物的鑒定結(jié)果克隆產(chǎn)物的鑒定結(jié)果圖圖8 8 凝膠電泳檢測(cè)菌落凝膠電泳檢測(cè)菌落PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以水作為模板的陰性對(duì)照；：以水作為模板的陰性對(duì)照； 2 2：第二輪：第二輪PCRPCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照；產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照； 3-43-4：菌落：菌落PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物兩個(gè)菌落均含兩個(gè)菌落均含有目的條帶有目的條帶 8、 5RACE第一輪第一輪PCR結(jié)果結(jié)果圖圖10 10 凝膠電泳檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)5RACE5RACE第一輪反響產(chǎn)物第一輪反響產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：第一

9、輪反響產(chǎn)物；：第一輪反響產(chǎn)物； 2 2：陰性對(duì)照：陰性對(duì)照 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生100-100-400bp400bp的拖帶，但還沒(méi)有的拖帶，但還沒(méi)有明顯條帶明顯條帶 9、5RACE第二輪PCR 結(jié)果圖圖11 11 凝膠電泳檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)5RACE5RACE第二輪反響產(chǎn)物第二輪反響產(chǎn)物 M M：DNA MarkerDNA Marker； 1 1：以水作為模板的陰性對(duì)照；：以水作為模板的陰性對(duì)照； 2 2：第二輪：第二輪PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 經(jīng)第二輪擴(kuò)增經(jīng)第二輪擴(kuò)增, ,在在300bp300bp左右處有特異左右處有特異性條帶出現(xiàn)并且陰性條帶出現(xiàn)并且陰性對(duì)照無(wú)條帶性對(duì)照無(wú)條帶 產(chǎn)物回收產(chǎn)物

10、回收 產(chǎn)物與載產(chǎn)物與載體的銜接體的銜接 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 初篩重組初篩重組子子 10、 5RACE克隆產(chǎn)物的鑒定克隆產(chǎn)物的鑒定 圖圖12 12 凝膠電泳檢測(cè)菌落凝膠電泳檢測(cè)菌落PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 M M：DNA ladderDNA ladder； 1 1：以水作為模板的陰性對(duì)照；：以水作為模板的陰性對(duì)照； 2 2：以第二輪：以第二輪PCRPCR產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照；產(chǎn)物為陽(yáng)性對(duì)照； 3-53-5：菌落：菌落PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物3 3個(gè)菌落均含個(gè)菌落均含有目的條帶有目的條帶 圖圖14 Rac基因部分序列及由此推測(cè)的氨基酸序列基因部分序列及由此推測(cè)的氨基酸序列 圖中陰影部分是編碼區(qū)；圖中陰影部分是編碼區(qū)； 下劃線標(biāo)注為終止密碼下劃線標(biāo)注為終止密碼TAA； 方框中是加尾信號(hào)方框中是加尾信號(hào)AATAAA獲得的片段大小為獲得的片段大小為1272bp，其中包含的編，其中包含的編碼區(qū)碼區(qū)579bp，編碼，編碼193個(gè)個(gè)氨基酸。氨基酸。5端非編碼區(qū)長(zhǎng)端非編碼區(qū)長(zhǎng)80bp3端非編碼區(qū)長(zhǎng)端非編碼區(qū)長(zhǎng)613bp，具有脊椎動(dòng)物典型的加尾具有脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)信號(hào)AATAA和和poly A尾尾巴巴 結(jié)論結(jié)論本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其它動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其它動(dòng)物Rac基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)過(guò)基因