酶學(xué)與酶工程第六章酶的固定化ppt課件

1、一、固定化酶一、固定化酶Immobilized EnzymeImmobilized Enzyme1. 1. 定義：固定化酶是指將水溶性的酶用物理或化定義：固定化酶是指將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法處置，使之成為不溶于水的，但是仍具有學(xué)的方法處置，使之成為不溶于水的，但是仍具有生物活性的酶。催化反響后的酶可以回收反復(fù)運(yùn)用。生物活性的酶。催化反響后的酶可以回收反復(fù)運(yùn)用。固定化酶優(yōu)點(diǎn)：固定化酶優(yōu)點(diǎn)：極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，簡化了提純工藝；極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開，簡化了提純工藝；可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)展反復(fù)分批反響和延續(xù)反響，酶的可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)展反復(fù)分批反響和延續(xù)反響，酶的運(yùn)用效率提高

2、，本錢降低；運(yùn)用效率提高，本錢降低；在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；酶反響過程可以加以嚴(yán)厲控制；酶反響過程可以加以嚴(yán)厲控制；較游離酶更適宜于多酶反響；較游離酶更適宜于多酶反響；可以添加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量?？梢蕴砑赢a(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量。固定化酶的缺陷：固定化酶的缺陷：由于多一步固定化操作，存在酶固定化過程中的活性收由于多一步固定化操作，存在酶固定化過程中的活性收率損失；率損失；由于固定化需用載體，因此多了載體本錢費(fèi)及固定化操由于固定化需用載體，因此多了載體本錢費(fèi)及固定化操作費(fèi)用；作費(fèi)用；固定化酶顆粒的分散阻力會(huì)使反響速率下降；固定化酶顆粒的分

3、散阻力會(huì)使反響速率下降；只能用于可溶性底物和小分子底物，對(duì)大分子底物不適只能用于可溶性底物和小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜。宜。必需留意維持酶的催化活性及專注性必需留意維持酶的催化活性及專注性應(yīng)該有利于消費(fèi)自動(dòng)化、延續(xù)化應(yīng)該有利于消費(fèi)自動(dòng)化、延續(xù)化應(yīng)有最小的空間位阻應(yīng)有最小的空間位阻酶與載體必需結(jié)合結(jié)實(shí)，從而使固定化酶能回收儲(chǔ)存，利酶與載體必需結(jié)合結(jié)實(shí)，從而使固定化酶能回收儲(chǔ)存，利于反復(fù)運(yùn)用于反復(fù)運(yùn)用固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物，產(chǎn)物或固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物，產(chǎn)物或反響液發(fā)生化學(xué)反響反響液發(fā)生化學(xué)反響固定化酶本錢要低，以利于工業(yè)運(yùn)用固定化酶本錢要低，以利于工業(yè)

4、運(yùn)用酶的固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性的載酶的固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。體結(jié)合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化方法有很多，但對(duì)任何酶都適用的方法是沒固定化方法有很多，但對(duì)任何酶都適用的方法是沒有的，必需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研討才干確定。有的，必需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研討才干確定。酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、結(jié)合法、酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法和熱處置法。交聯(lián)法和熱處置法。1.1.吸附法吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其外利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其外表上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡表

5、上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。稱吸附法。物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。石等。操作簡便，條件溫暖，不會(huì)引起酶變性失活，載操作簡便，條件溫暖，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)運(yùn)用體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)運(yùn)用于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不結(jié)實(shí)而容易零落，不結(jié)實(shí)而容易零落，2.2.包埋法包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，

6、使酶固定化的方法稱為包埋法?；姆椒ǚQ為包埋法。包埋法可分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法半透膜包埋法可分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法半透膜法法將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為凝膠包埋法；凝膠包埋法；將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微膠囊將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微膠囊法。包埋法普通不需求與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)展法。包埋法普通不需求與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)展結(jié)合反響，因此可以運(yùn)用于許多酶、微生物的固定結(jié)合反響，因此可以運(yùn)用于許多酶、微生物的固定化?；? 1凝膠包埋法凝膠包埋法 凝膠包埋法是運(yùn)用最廣泛的固定化方法凝膠包埋法是運(yùn)用最

7、廣泛的固定化方法 主要用包埋載體：主要用包埋載體： 瓊脂凝膠，瓊脂凝膠， 海藻酸鈣凝膠，海藻酸鈣凝膠， 角叉菜膠，角叉菜膠， 明膠，明膠， 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠2 2微膠囊法微膠囊法 微膠囊固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的微膠囊固定化酶通常為直徑幾微米到幾百微米的球狀體，比凝膠包埋顆粒要小得多，底物和產(chǎn)物分球狀體，比凝膠包埋顆粒要小得多，底物和產(chǎn)物分散阻力較小，但是反響條件要求高，制備本錢也高。散阻力較小，但是反響條件要求高，制備本錢也高。界面沉淀法或稱相分別法 利用某些聚合物在水相和有機(jī)相溶解度極低而構(gòu)成薄膜將酶包埋。界面聚合法 利用親水性單體和疏水性單體在界面發(fā)生聚合的原理包埋

8、酶二級(jí)乳化法脂質(zhì)體包埋法 由外表活性劑和卵磷脂等構(gòu)成液膜包埋酶3. 3. 結(jié)合法結(jié)合法 選擇適宜的載體，經(jīng)過共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合選擇適宜的載體，經(jīng)過共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一同的固定化方法稱為結(jié)合法?？煞譃殡x子鍵結(jié)在一同的固定化方法稱為結(jié)合法?？煞譃殡x子鍵結(jié)合法，共價(jià)鍵結(jié)合法兩種。合法，共價(jià)鍵結(jié)合法兩種。 1 1離子鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法 在適宜的在適宜的pHpH和離子強(qiáng)度條件下，酶經(jīng)過離子鍵結(jié)合于具有和離子強(qiáng)度條件下，酶經(jīng)過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法，因此也稱離子離子交換基的水不溶性載體的固定化方法，因此也稱離子交換吸附法。交換吸附法。離子結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，

9、處置條件溫暖，酶的高離子結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡單，處置條件溫暖，酶的高級(jí)構(gòu)造和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活級(jí)構(gòu)造和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率高的固定化酶?；厥章矢叩墓潭ɑ?。缺陷是：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或缺陷是：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pHpH的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)展反響時(shí)，酶往往會(huì)的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)展反響時(shí)，酶往往會(huì)從載體上零落。從載體上零落。2) 2) 共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法是指借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合法是指借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)展偶聯(lián)的固定化方

10、法?；鶊F(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)展偶聯(lián)的固定化方法。載體有：天然高分子衍生物，如纖維素、葡聚糖凝載體有：天然高分子衍生物，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰膠、膠、瓊脂糖等；人工合成的高聚物，如聚丙烯酰膠、多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐的共聚物、聚苯多聚氨基酸、乙烯與順丁烯二酸酐的共聚物、聚苯乙烯、尼龍等乙烯、尼龍等 酶和載體的偶聯(lián)反響有多種，取決于載體上的功酶和載體的偶聯(lián)反響有多種，取決于載體上的功能基團(tuán)與酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)。能基團(tuán)與酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)。載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)間載體上的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團(tuán)間不具有直接反響的才干

11、，所以要經(jīng)過兩類方法來處不具有直接反響的才干，所以要經(jīng)過兩類方法來處理：一是將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)理：一是將載體有關(guān)基團(tuán)活化，然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反響；另一種是在載體上接上一個(gè)雙功能發(fā)生偶聯(lián)反響；另一種是在載體上接上一個(gè)雙功能試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。試劑，然后將酶偶聯(lián)上去。重氮反響重氮反響是帶芳香氨基的水不溶性載體的主要反響，載體在稀鹽酸和亞硝是帶芳香氨基的水不溶性載體的主要反響，載體在稀鹽酸和亞硝酸鈉中進(jìn)展反響，成為重氮鹽衍生物，然后再在溫暖的條件下和酸鈉中進(jìn)展反響，成為重氮鹽衍生物，然后再在溫暖的條件下和酶蛋白分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基、咪唑基直接進(jìn)展偶聯(lián)酶蛋白分子上相應(yīng)的

12、基團(tuán)如酚羥基、咪唑基直接進(jìn)展偶聯(lián)溴化氰法：對(duì)于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖溴化氰法：對(duì)于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等來說，這是最常用的反響。等來說，這是最常用的反響。芳香烴化反響：含羥基的載體也可在堿性條件下和三氯均芳香烴化反響：含羥基的載體也可在堿性條件下和三氯均三嗪等反響，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚三嗪等反響，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚基或巰基等偶聯(lián)?；驇€基等偶聯(lián)。疊氮反響：適用于含羥基、羧甲基等的載體，如疊氮反響：適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CMCM纖維纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯順丁烯二酸酐共聚物等。素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯順丁烯二酸

13、酐共聚物等。共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合結(jié)實(shí)，穩(wěn)定性好，普通共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合結(jié)實(shí)，穩(wěn)定性好，普通不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等緣由而隨便零落，這有利不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等緣由而隨便零落，這有利于延續(xù)運(yùn)用于延續(xù)運(yùn)用缺陷：該方法反響條件苛刻，操作復(fù)雜，而且由于采用了缺陷：該方法反響條件苛刻，操作復(fù)雜，而且由于采用了比較猛烈的反響條件，能夠會(huì)引起酶蛋白高級(jí)構(gòu)造的變化，比較猛烈的反響條件，能夠會(huì)引起酶蛋白高級(jí)構(gòu)造的變化，破壞部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化破壞部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，其酶活回收率一股為酶，其酶活回收率一股為3030左右，有時(shí)甚

14、至底物的專注左右，有時(shí)甚至底物的專注性等酶的性質(zhì)也會(huì)因固定化而發(fā)生變化性等酶的性質(zhì)也會(huì)因固定化而發(fā)生變化維護(hù)措施：維護(hù)措施：應(yīng)選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體，例如，采應(yīng)選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體，例如，采用重氮法時(shí)要留意載體的親水性與疏水性，用重氮法時(shí)要留意載體的親水性與疏水性，嚴(yán)厲控制反響條件，提高反響的專注性，例如使反嚴(yán)厲控制反響條件，提高反響的專注性，例如使反響局限于響局限于-氨基，維護(hù)氨基，維護(hù)-氨基，氨基，運(yùn)用可逆抑制劑或底物，封鎖或牽制酶的活性中心運(yùn)用可逆抑制劑或底物，封鎖或牽制酶的活性中心與必需基團(tuán)，防止試劑影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基與必需基團(tuán)，防止試劑影響酶的活性構(gòu)型和相

15、應(yīng)基團(tuán)。團(tuán)。4. 4. 交聯(lián)法交聯(lián)法交聯(lián)法是指利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、交聯(lián)法是指利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)展交聯(lián)反酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)展交聯(lián)反響，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法。它與共價(jià)結(jié)合響，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法。它與共價(jià)結(jié)合法的不同之處是它不運(yùn)用載體。法的不同之處是它不運(yùn)用載體。酶蛋白的功能團(tuán)有酶蛋白的功能團(tuán)有N N末端的末端的氨基、賴氨酸的氨基、賴氨酸的-氨氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基等唑基等雙功能和多功能試劑根據(jù)它們的功能基團(tuán)一樣與不雙功能和多功能試

16、劑根據(jù)它們的功能基團(tuán)一樣與不同可分為同可分為“同型和同型和“雜型兩類其中員常用的交雜型兩類其中員常用的交聯(lián)劑是戊二醛。聯(lián)劑是戊二醛。 交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，其缺陷那么是交聯(lián)反響的過程往往比較猛烈，許多酶易在固定化過程中失效，酶回收率不高。 1) 采用某些維護(hù)措施 2) 盡能夠降低交聯(lián)劑濃度和縮短反響時(shí)間，有利于固定化酶比活力的提高。5.5.熱處置法熱處置法6.6.各種固定化酶方法的優(yōu)缺陷比較各種固定化酶方法的優(yōu)缺陷比較1 1酶的活性酶的活性 2 2酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性 固定化添加了酶活性構(gòu)象的結(jié)實(shí)程度固定化添加了酶活性構(gòu)象的結(jié)實(shí)程度 抑制酶的本身降解抑制酶的本身降解 固定化部分阻撓了外界不利

17、要素對(duì)酶的侵襲固定化部分阻撓了外界不利要素對(duì)酶的侵襲固定化酶穩(wěn)定性升高表如今以下方面固定化酶穩(wěn)定性升高表如今以下方面 固定化添加了酶的耐熱性固定化添加了酶的耐熱性 固定化增大了酶對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗才干固定化增大了酶對(duì)變性劑、抑制劑的抵抗才干 固定化減輕了蛋白酶的破壞作用固定化減輕了蛋白酶的破壞作用 固定化可以加強(qiáng)儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性固定化可以加強(qiáng)儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性3 3酶的最適溫度酶的最適溫度4 4酶的最適酶的最適pHpH5 5酶的動(dòng)力學(xué)特征酶的動(dòng)力學(xué)特征6 6酶的作用專注性酶的作用專注性1 1酶的活力酶的活力固定化酶固定化酶( (細(xì)胞細(xì)胞) )的活力即是固定化酶的活力即是固定化酶(

18、 (細(xì)胞細(xì)胞) )催化某催化某一特定化學(xué)反響的才干，其大小可用在一定條件下一特定化學(xué)反響的才干，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反響的反響初速度來表示。它所催化的某一反響的反響初速度來表示。固定化酶固定化酶( (細(xì)胞細(xì)胞) )的單位可定義為：每毫克干重固定的單位可定義為：每毫克干重固定化酶化酶( (細(xì)胞細(xì)胞) )每分鐘轉(zhuǎn)化底物每分鐘轉(zhuǎn)化底物( (或消費(fèi)產(chǎn)物或消費(fèi)產(chǎn)物) )的量，的量，測定方法分為間歇測定和延續(xù)測定兩種測定方法分為間歇測定和延續(xù)測定兩種 1) 1)間歇測定間歇測定 在攪拌或振蕩反響器中，與溶液在攪拌或振蕩反響器中，與溶液酶同樣測定條件下酶同樣測定條件下( (如均勻懸浮于保溫的

19、介質(zhì)中如均勻懸浮于保溫的介質(zhì)中) )進(jìn)進(jìn)展，然后間隔一定時(shí)間取樣，過濾后按常規(guī)酶活測展，然后間隔一定時(shí)間取樣，過濾后按常規(guī)酶活測定方法進(jìn)展測定。定方法進(jìn)展測定。 2) 2)延續(xù)測定延續(xù)測定 將固定化酶裝入具有恒溫水夾套的將固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。2 2蛋白總量蛋白總量 (1) (1)雙辛可寧酸法雙辛可寧酸法(BCA(BCA法法) ) (2) (2)考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法3 3偶聯(lián)率及相對(duì)活力偶聯(lián)率及相對(duì)活力偶聯(lián)率偶聯(lián)率( (參與蛋白活力一上清液蛋白活力參與蛋白活力一上清液蛋白活力) )參與參與 蛋白活力蛋

20、白活力X100X100 活力回收固定化酶總活力參與酶的總活力活力回收固定化酶總活力參與酶的總活力100100 相對(duì)活力固定化酶總活力相對(duì)活力固定化酶總活力( (參與酶的總活參與酶的總活力一上清液中未偶聯(lián)酶活力力一上清液中未偶聯(lián)酶活力)X100)X1004 4半衰期半衰期固定化酶固定化酶( (細(xì)胞細(xì)胞) )的半衰期是指在延續(xù)測定條件下，的半衰期是指在延續(xù)測定條件下，固定化酶固定化酶( (細(xì)胞細(xì)胞) )的活力下降為最初活力一半所閱歷的活力下降為最初活力一半所閱歷的延續(xù)任務(wù)時(shí)間，以的延續(xù)任務(wù)時(shí)間，以t1/2t1/2表示。表示。將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定

21、空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。一、一、 固定化細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞的特點(diǎn)具有固定化酶的特定，同時(shí)又具有本身的優(yōu)勢：具有固定化酶的特定，同時(shí)又具有本身的優(yōu)勢：固定化細(xì)胞堅(jiān)持了細(xì)胞的完好構(gòu)造和天然形狀，固定化細(xì)胞堅(jiān)持了細(xì)胞的完好構(gòu)造和天然形狀，穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好堅(jiān)持了細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)、輔酶體系和代謝調(diào)控堅(jiān)持了細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來的代謝途徑進(jìn)展新陳代謝，體系，可以按照原來的代謝途徑進(jìn)展新陳代謝，并進(jìn)展有效的代謝調(diào)理控制并進(jìn)展有效的代謝調(diào)理控制發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)運(yùn)用或者延續(xù)運(yùn)用較長發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)運(yùn)用或者延續(xù)運(yùn)用較長的一段時(shí)間的一段時(shí)間固定化細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率固定化細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率提高固定化工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性提高固定化工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性缺陷：缺陷：必需堅(jiān)持菌體的完好，防止菌體的自溶，否那么影必需堅(jiān)持菌體的完好，防止菌體的自溶，否那么影響產(chǎn)物的純度響產(chǎn)物的純度