中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范2010年版95抗生素微生物檢定法

1、抗生素微生物檢定法1 簡(jiǎn)述生素微生物檢定法系在適宜條件下，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法。依試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理不同，可分為稀釋法、比濁法和瓊脂擴(kuò)散法。后二者被列為抗生素微生物檢定的國(guó)際通用方法。中國(guó)藥典也采用這兩種方法?？股匚⑸餀z定管碟測(cè)定法系瓊脂擴(kuò)散法，是利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)成球面形擴(kuò)散，形成含一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈。此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。抗生素微生物比濁法是

2、將一定量的抗生素加至接種有試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基內(nèi)，混勻后，經(jīng)培養(yǎng)，測(cè)量培養(yǎng)基的濁度。此法系根據(jù)抗生素在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度或濃度的數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值與試驗(yàn)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的濁度（濁度與細(xì)菌數(shù)量、細(xì)菌群體質(zhì)量及細(xì)菌細(xì)胞容積的增加之間存在直接關(guān)系）之間存在線性關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)晶與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，計(jì)算出供試品的效價(jià)?？股匦r(jià)以“單位（U）”或“微克（g）”表示?？股毓艿鷾y(cè)定法2 儀器與用具2.1 操作室 光線明亮，操作室應(yīng)分為兩部分，彼此分開，其中一部分為一般操作室，一部分為半無(wú)菌操作室。半無(wú)菌操作室應(yīng)設(shè)有紫外線滅菌燈，并附設(shè)空氣凈化（空氣凈化級(jí)別為1001

3、0000級(jí)）及空調(diào)設(shè)備，控制室溫在2025之間，達(dá)到無(wú)菌或半無(wú)菌狀態(tài)。操作臺(tái)應(yīng)穩(wěn)固，臺(tái)面用玻璃板，并用水平儀調(diào)節(jié)至水平。注意操作，避免室內(nèi)抗生素污染。2.2 雙碟 內(nèi)徑約90mm，高1617mm硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無(wú)色斑氣泡。碟底平度檢查，可將雙碟放在水平臺(tái)上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水23ml，再滴加藍(lán)墨水，觀察藍(lán)色深淺是否一致。用過(guò)的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置清洗液中浸泡過(guò)夜，沖洗，瀝干，置150160干熱滅菌2h或高壓121蒸氣滅菌30min，備用。2.3 陶瓦蓋 內(nèi)徑約103mm，外徑108mm，平坦，吸水性強(qiáng)，應(yīng)定期清洗、干燥或干熱滅菌。2.4 鋼管 內(nèi)徑

4、（6.0±0.1mm），高（10.0±0.1）mm，外徑（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套鋼管重量差異不超過(guò)±0.05g，內(nèi)外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致。每次使用后應(yīng)置1：1000新潔爾滅溶液內(nèi)，浸泡2h以上，滅菌后再洗滌，先用水洗滌，超聲波超聲30min或用沾有去污粉的紗布條串擦內(nèi)外壁，水沖洗，瀝干，再用蒸餾水沖洗.次后，置帶蓋的容器內(nèi)，在150160干熱滅菌2h，備用。2.5 鋼管放置器 有6孔和4孔兩種。放置于無(wú)菌或半無(wú)菌室的操作平臺(tái)上，鋼管下落時(shí)應(yīng)垂直平穩(wěn)、位置正確。雙碟升降平穩(wěn)。應(yīng)保持清潔，防止抗生素污染。可定

5、期用-(4乙醇棉擦拭落管筒及儲(chǔ)管杯。置鋼管的玻璃管應(yīng)定期干烤滅菌。2.6 恒溫培養(yǎng)箱 以隔水式為宜，溫度平穩(wěn)，波動(dòng)小。除另有規(guī)定外，依各品種項(xiàng)下要求設(shè)定溫度，溫度波動(dòng)范圍為3537或2426，箱內(nèi)網(wǎng)狀隔板上放置帶孔的玻璃板并調(diào)整水平。2.7 滅菌刻度吸管 用于吸取菌液及培養(yǎng)基。使用后應(yīng)立即置5%石炭酸或1：1000新潔爾滅溶液中消毒后，再按玻璃容器的常規(guī)洗滌法洗滌。洗滌瀝干后在吸口處塞入脫脂棉（松動(dòng)，透氣），置適宜容器中，在120以上干熱滅菌2h或121蒸氣滅菌30min，烘干備用。2.8 玻璃容器 包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均應(yīng)符合“常用玻璃量器國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程”的規(guī)定。每次使用前

6、用清潔液浸泡，水沖洗，并用蒸餾水或去離子水沖洗3次，瀝干。2.9 稱量瓶 重量在10g以下。用畢先用水沖洗、瀝干，置清潔液浸泡2h以上，然后分別用水、蒸餾水或去離子水沖洗3次，置潔凈平皿中，在120干熱滅菌3h，待冷至6070時(shí)，取出置于干燥器中備用。2.10 滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清潔液浸泡，分別用水、蒸餾水或去離子水沖洗3次，置適宜容器中，在120干燥3h后備用。2.11 天平 分析天平，精密度0.1mg，經(jīng)計(jì)量檢定。2.12 抑菌圈直徑（面積）測(cè)量?jī)x 應(yīng)符合“抑菌圈測(cè)量?jī)x檢定規(guī)程”的規(guī)定。2.13 游標(biāo)卡尺 精度0.05mm，長(zhǎng)度125mm。2.14 超凈工作臺(tái) 有效工作

7、面局部潔凈度100級(jí)。用于試驗(yàn)菌的接種傳代或菌懸液制備。超凈工作臺(tái)須置潔凈工作室或半無(wú)菌室內(nèi)。3 試液3.1 滅菌緩沖液 制備緩沖液的試劑應(yīng)為分析純，配制后的緩沖液應(yīng)澄明，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121蒸氣滅菌30min備用。2.2 磷酸鹽緩沖液（pH5.6） 取磷酸二氫鉀9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.6，濾過(guò)，在115滅菌30min。3.3 磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過(guò)。3.4 磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 取磷酸氫二鉀（K2HPO4·12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀 3.5g，加

8、水使成1000ml，濾過(guò)。3.5 磷酸鹽緩沖液（pH7.8） 取磷酸氫二鉀3.6 磷酸鹽緩沖液（pH10.5） 取磷酸氫二鉀35g，加氫氧化鉀溶液（10mol/L）2ml，水使成1000ml，濾過(guò)。4 培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基的各成分原料質(zhì)量對(duì)抑菌圈邊緣清晰度及試驗(yàn)結(jié)果影響較大，因此應(yīng)對(duì)原材料進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，挑選適當(dāng)?shù)钠放剖褂?。制成的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如產(chǎn)生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，于115加熱20min溶化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過(guò)濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。中國(guó)藥典2010年版二部附錄的抗生素微生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時(shí)按照使用說(shuō)

9、明進(jìn)行配制，但應(yīng)注意核對(duì)培養(yǎng)基的pH，必要時(shí)需調(diào)節(jié)pH，使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量也存在差異，注意選擇合適的產(chǎn)品。5 試驗(yàn)菌5.1 菌種的復(fù)蘇 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種為冷凍干燥品，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。 取凍干菌種管、滅菌1ml毛細(xì)滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，移入接種室操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)。 將凍干菌種管外壁用碘酒（碘伏）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在上述灼熱的菌種管封口端，使其驟冷炸裂。 取滅菌鑷子，在酒精燈火焰上方，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙

10、碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動(dòng)使其溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將毛細(xì)滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面置3537培養(yǎng)2224h。 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌，涂片并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如呈典型菌落，則轉(zhuǎn)種)代即可使用。菌落不典型時(shí)，可進(jìn)行平板分離單菌落。5.2 菌種的接種與保存 準(zhǔn)備需用的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備，如斜面已無(wú)冷凝水者，不宜再使用。在標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。從冷藏箱中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30min，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。 點(diǎn)燃酒精

11、燈或煤氣燈等，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30s，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)3次。右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰上方。塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折蛇形移動(dòng)，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。 取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌

12、。 將已接種的細(xì)菌管置3537培養(yǎng)2224h，霉菌管一般置2425霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后放入4冷藏箱內(nèi)保存，一般13個(gè)月轉(zhuǎn)種1次。5.3 菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌BacillUs sUbtilis CMCC(B)63 501懸液 取枯草芽孢桿菌工作用，菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，加滅菌水12ml將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將此懸液接種至盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，均勻攤布，在3537培養(yǎng)7天。取菌苔少許涂片，革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水10ml將芽孢洗下，制成芽孢懸液，合并至滅菌大試管內(nèi)，在65水浴中加熱30分鐘將菌體殺死，待冷后置4冷藏箱貯藏。此菌液為濃菌液。日常試驗(yàn)

13、用菌液 取上述濃菌液，用滅菌水1:3稀釋至滅菌試管中，冷藏箱保存?zhèn)溆谩?短小芽孢桿菌BacillUs pUmilUs CMCC(B)63 202懸液 取短小芽孢桿菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備芽孢懸液。 金黃色葡萄球菌StaphylococcUs aUreUs CMCC(B)26 003懸液 取金黃色葡萄球菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022h，臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，制成懸液。置4冷藏箱保存，可使用3天。 藤黃微球菌MicrococcUs lUteUs CMCC(B)28 001懸液 取藤黃微球菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂

14、斜面培養(yǎng)物，用1ml培養(yǎng)基!將菌苔洗下，用吸管移至盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶中，均勻攤布，將培養(yǎng)瓶倒置于培養(yǎng)箱中2627培養(yǎng)24h取出，用吸管吸取培養(yǎng)基或0.9%滅菌氯化鈉溶液5ml至培養(yǎng)瓶中，將菌苔洗下，合并菌液至滅菌大試管中備用。置4冰箱中保存，可使用12個(gè)月。 大腸桿菌Eschehchia coli CMCC(B)44 103懸液 取大腸桿菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項(xiàng)下的方法制備菌懸液，供當(dāng)日使用。 肺炎克雷伯氏菌Klebosiella pneUmoniae CMCC(B)46 117懸液 取肺炎克雷伯氏菌工作用菌種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液

15、項(xiàng)下的方法制備菌懸液，供當(dāng)日使用。 啤酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763懸液 取啤酒酵母菌的V號(hào)培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種于號(hào)培養(yǎng)基斜面上，在3235培養(yǎng)24h，用滅菌水將菌苔洗下，放至含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，以當(dāng)日使用為宜。試驗(yàn)菌的菌齡對(duì)抑菌圈邊緣清晰度有一定影響，應(yīng)保持菌種新鮮。對(duì)易變異的菌株如藤黃微球菌等，宜在制備菌液前進(jìn)行單菌落的分離，選擇典型菌落以保持菌懸液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈邊緣清晰、整齊。6 操作法6.1 稱量 稱量前先將標(biāo)準(zhǔn)晶從冰箱中取出，使其溫度與室溫平衡。 供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的稱量應(yīng)使用同一架天平

16、；對(duì)于吸濕性較強(qiáng)的抗生素，應(yīng)在稱量前12h更換天平內(nèi)干燥劑。 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量盡量一次取樣稱取，不得將已取出的稱取物倒回原容器內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品的稱取量不得少于20mg，取樣后立即將盛有樣品的稱量瓶或適宜的容器用蓋蓋好，以免吸水。稱樣量的計(jì)算：W=式中 W為需稱取標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的重量（mg）；V為溶解標(biāo)準(zhǔn)品或供試品制成濃溶液時(shí)用容量瓶的體積（ml）；C為標(biāo)準(zhǔn)品或供試品濃溶液的濃度（U/ml或g/ml）；P為標(biāo)準(zhǔn)品的純度或供試品的估計(jì)效價(jià)（U/mg或g/mg）。6.2 稀釋 稀釋操作應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程進(jìn)行。 用于溶解及稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的容量瓶和移液管等玻璃量器，應(yīng)按“常用玻璃量器國(guó)家計(jì)量檢定

17、規(guī)程”進(jìn)行標(biāo)定，符合A級(jí)的要求。每步稀釋，量取量不得少于2ml，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。舉例：量取貯備液（1000U/ml），進(jìn)行以下稀釋。第一步 精密量取5ml（1000U/ml）100 U/ml第二步 精密量取5ml（100U/ml）10 U/ml精密量取5ml（100U/ml）5 U/ml 量取供試溶液盡量使用刻度移液管，正式量取前要用供試液流洗23次，吸取供試溶液后，用濾紙將外壁多余液體拭去，從起始刻度開始放溶液。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液應(yīng)使用同一緩沖液（溶劑）稀釋，以避免因pH.或濃度不同而影響測(cè)定結(jié)果。 稀釋時(shí)，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加

18、至刻度。 二劑量（2.2）法的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液高、低濃度之比為2:1或4:1。三劑量（3.3）法的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液高、中、低溶液濃度之比為1:0.8。但所選用的濃度必須在劑量反應(yīng)直線范圍內(nèi)。6.3 雙碟制備 雙碟的制備應(yīng)在半無(wú)菌室或潔凈室內(nèi)進(jìn)行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐內(nèi)融化，避免直火加熱。 底層 用滅菌大口20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于3537培養(yǎng)箱中保溫，使菌層易于攤布。 菌層 取出試驗(yàn)用菌懸液，按預(yù)試好的加菌量（2.2）法標(biāo)準(zhǔn)晶溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在1822mm，（3

19、.3）法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在1518mm，用滅菌吸管吸取菌懸液適量，加入已融化并保溫在水浴中（水浴溫度，細(xì)菌為48500，芽孢可至60）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，作為菌層培養(yǎng)基用。取出加有底層培養(yǎng)基的雙碟，用滅菌大口5ml、10ml吸管或其他適宜分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，加于底層培養(yǎng)基上，使其均勻攤布，用干燥陶瓦蓋覆蓋，放置2030min，待凝固。 放置鋼管 用鋼管放置器，將滅菌的鋼管放入貯管筒（杯）內(nèi)，按說(shuō)明書的要求操作，使鋼管平穩(wěn)地落在培養(yǎng)基上，注意使各鋼管下落的高度基本一致。如無(wú)鋼管放置器，可用小眼科鑷子夾持鋼管，輕輕地放置在培養(yǎng)基上，相應(yīng)劑量的鋼管對(duì)角均勻放置。鋼管放妥后

20、，應(yīng)使雙碟靜置510min，鋼管在瓊脂上沉穩(wěn)后，再開始滴加抗生素溶液。6.4 滴加抗生素溶液 每批供試品取不少于6個(gè)雙碟，滴加溶液用滅菌毛細(xì)滴管或微量加樣器（調(diào)節(jié)加樣量約為200300l），在滴加之前須用溶液洗23次。 滴加標(biāo)準(zhǔn)晶及供試品溶液順序，因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方法不同而異。（2.2）法，在雙碟的4個(gè)鋼管中分別成“Z”字形滴加標(biāo)準(zhǔn)品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序?yàn)镾HTHTLSL；（3.3）法的6個(gè)鋼管中間隔3個(gè)鋼管中分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品及供試品高（H）、中（M）、低（L）3種濃度溶液，并使相同濃度成對(duì)角，滴加順序?yàn)镾HTHSMTMSLTL。滴加溶液至鋼管口平滿，

21、注意滴加溶液的間隔不可過(guò)長(zhǎng)，否則因鋼管內(nèi)溶液的擴(kuò)散時(shí)間不同會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。 每份滴加的溶液為同一單位，但雙碟數(shù)每次不超過(guò)5個(gè)，如果1份溶液滴加雙碟數(shù)目多，可分次滴加。每種溶液各用1支毛細(xì)滴管。 滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過(guò)3層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小。將雙碟托盤水平平穩(wěn)地移入培養(yǎng)箱中間位置，在3537或該藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的溫度下培養(yǎng)至所需時(shí)間。6.5 抑菌圈測(cè)量 將培養(yǎng)好的雙碟取出，拿掉陶瓦蓋，將鋼管倒入盛有1:1000新潔爾滅（苯扎溴銨）溶液或其他消毒液內(nèi)滅菌，換以玻璃蓋；測(cè)量抑菌圈前，應(yīng)檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整，應(yīng)舍棄該碟，切忌主觀挑選雙

22、碟或抑菌圈，以免造成測(cè)定結(jié)果的偏倚。 測(cè)量抑菌圈可以使用抑菌圈測(cè)量?jī)x，也可用游標(biāo)卡尺；使用的抑菌圈測(cè)量?jī)x應(yīng)經(jīng)過(guò)檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時(shí)應(yīng)按儀器的操作規(guī)程進(jìn)行：使用游標(biāo)卡尺測(cè)量時(shí)，眼睛視線應(yīng)與讀數(shù)刻度垂直，用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點(diǎn)成垂直方向測(cè)量。7 記錄與計(jì)算7.1 記錄 試驗(yàn)記錄應(yīng)包括抗生素藥品名稱、規(guī)格、批號(hào)、生產(chǎn)廠、檢品編號(hào)、檢驗(yàn)依據(jù)、檢驗(yàn)日期、溫度、相對(duì)濕度、標(biāo)準(zhǔn)品名稱、標(biāo)準(zhǔn)晶批號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示含量、試驗(yàn)菌名稱及菌懸液濃度、培養(yǎng)基名稱、來(lái)源及批號(hào)、緩沖液名稱及pH、供試品估計(jì)效價(jià)、抑菌圈測(cè)量?jī)x型號(hào)及編號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量、稀釋步驟、試驗(yàn)人與校核人、抑菌圈測(cè)量

23、及數(shù)據(jù)處理結(jié)果。當(dāng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)，應(yīng)將測(cè)得數(shù)據(jù)按相應(yīng)劑量濃度以列表形式記錄。用測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌圈面積或直徑時(shí)，應(yīng)將儀器的測(cè)量、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及計(jì)算結(jié)果打印后貼附于記錄頁(yè)上。7.2 計(jì)算 二劑量法（2.2法）效價(jià)計(jì)算公式式中 P為供試品效價(jià)（相當(dāng)于標(biāo)示量或估計(jì)效價(jià)的百分?jǐn)?shù)）；S2為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T2為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T1為供試品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；I為高、低劑量之比的對(duì)數(shù)值，2:1時(shí)，i=0.301。4:1時(shí)，I=0.602。舉例 乳糖酸紅霉

24、素效價(jià)測(cè)定結(jié)果計(jì)算（表1）表1 抑菌圈面積測(cè)量結(jié)果碟數(shù)抑菌圈面積S2S1T2T111571127615811268214811199152311733152313021497126341518121415331226515731237154312686154612191580122471495126015261240815301237154812639160512561593129310164912721608132015 49112 47215 53212 528估計(jì)效價(jià)（AT）=603U/mg劑距（I）=0.301效價(jià)（PT）=P×AT=101.1%×603U/mg=6

25、09.8U/mg 三劑量法（3.3法）效價(jià)計(jì)算公式式中 S3為標(biāo)準(zhǔn)品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S2為標(biāo)準(zhǔn)品中間濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S1為標(biāo)準(zhǔn)品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T3為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T2為供試品中間濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；T1為供試品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和。I為高、低濃度劑量之比的對(duì)數(shù)值，1:0.8時(shí)，I=0.0969。舉例 新霉素效價(jià)測(cè)定結(jié)果計(jì)算（表2）。表2 抑菌圈直徑測(cè)量結(jié)果碟數(shù)抑菌圈面積S1S2S3T1T2T3116.0516.2016.5015.8016.35

26、16.60216.2016.4516.6516.2016.4516.70316.0016.4516.7016.0516.3516.70415.9516.3516.6016.0016.2516.60515.7016.2516.6015.8516.2516.60615.5516.2016.5515.7016.2016.60715.6516.2016.4015.8016.1516.40815.9016.1016.4515.8016.1016.50915.6016.0016.3015.7015.9516.30142.60146.20148.75142.90146.05149.00估計(jì)效價(jià)（AT）=67

27、0U/mg劑距（I）=0.0969=101.1%效價(jià)（PT）=P×AT=101.1%×670U/mg=676.7U/mg8 結(jié)果判定8.1 可靠性測(cè)驗(yàn) 管碟法系根據(jù)量反應(yīng)平行線原理而設(shè)計(jì)，并要求在試驗(yàn)所用的劑量（濃度）范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量（濃度）與反應(yīng)呈直線關(guān)系?？煽啃詼y(cè)驗(yàn)即通過(guò)對(duì)劑間變異的分析，以測(cè)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)晶和供試品的對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)的關(guān)系是否顯著偏離平行直線。（2.2）法的劑間變異分析為試品間、回歸和偏離平行三項(xiàng)；（3.3）法還需再分析二次曲線和反向二次曲線。如用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，可用（2.2）法和（3.3）法的專用數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和結(jié)果計(jì)算。用抑菌圈

28、測(cè)量?jī)x測(cè)量抑菌圈時(shí)，測(cè)量與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理一次完成，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行 8的顯著性測(cè)驗(yàn)。（2.2）法要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01），偏離平行不應(yīng)顯著（P>0.05）；（3.3）法除（2.2）法的上述規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應(yīng)不顯著（P>0.05），符合以上各項(xiàng)規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算。8.2 可信限率 考核試驗(yàn)的精密度，除藥典各論另有規(guī)定外，管碟法的可信限率不得超過(guò)5%。上述各項(xiàng)都能符合者，試驗(yàn)結(jié)果成立。8.3 試驗(yàn)計(jì)算所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初

29、試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。8.4 原料藥效價(jià)測(cè)定一般需做雙份樣品平行試驗(yàn)，以便核對(duì)。對(duì)于檢驗(yàn)結(jié)果不符合規(guī)定的樣品，應(yīng)有可靠性測(cè)驗(yàn)及可信限率均符合規(guī)定，且測(cè)定結(jié)果在估計(jì)效價(jià)（原料藥）或標(biāo)示量（制劑）±10%范圍內(nèi)的至少兩個(gè)效價(jià)測(cè)定結(jié)果，必要時(shí)應(yīng)請(qǐng)其他檢驗(yàn)人員復(fù)核，才能發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。8.5 效價(jià)測(cè)定結(jié)果的有效數(shù)字按中國(guó)藥典規(guī)定及數(shù)字修約的原則取舍。9 操作要點(diǎn)9.1 抗生素原料藥 不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價(jià)以純度（U/mg或g/mg）表示。檢驗(yàn)時(shí)，可參考該品種的藥品標(biāo)準(zhǔn)純度限度規(guī)定或廠方提供的純度估計(jì)效價(jià)，取樣試驗(yàn)，如估計(jì)效價(jià)與實(shí)際效價(jià)相差較遠(yuǎn)時(shí)，即測(cè)定所得效價(jià)超出估計(jì)

30、效價(jià)的±10%時(shí)，則重新估計(jì)效價(jià)，再做準(zhǔn)確測(cè)定。原料藥一般皆以干燥品或無(wú)水物折算效價(jià)，須先測(cè)其含水或未折干效價(jià)，再根據(jù)供試品的水分或干燥失重測(cè)定結(jié)果折算成無(wú)水物或干燥品的效價(jià)。干燥品或無(wú)水物效價(jià)（U/mg）=9.2 抗生素制劑 粉針劑 指注射用無(wú)菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓶?jī)?nèi)，一般測(cè)定其純度（U/mg或g/mg）或整瓶效價(jià)。取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，稱取適量（50mg以上，根據(jù)標(biāo)示量及平均裝量折算估計(jì)效價(jià)，并按估計(jì)效價(jià)及量瓶體積計(jì)算取樣量），置量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，稀釋，測(cè)定，計(jì)算出1mg的效價(jià)單位數(shù)，再根據(jù)平均裝量及標(biāo)示量計(jì)算平均每瓶的百分含量。 水針

31、劑（注射液） 即抗生素的滅菌水溶液，標(biāo)示量一般按每毫升含效價(jià)單位計(jì)。效價(jià)測(cè)定時(shí)，量取平均裝量項(xiàng)下的內(nèi)容物或510支的內(nèi)容物，混勻，用干燥的刻度吸管吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部?jī)?nèi)壁緩緩流放入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結(jié)晶析出）的量瓶?jī)?nèi)，混勻，繼續(xù)加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規(guī)定的濃度。 片劑 包括素片、薄膜衣片、糖衣片及腸溶片。素片、薄膜衣片 稱取20片的總量，求出平均片重，研細(xì)混勻后，精密稱取適量（約相當(dāng)于1片的重量或根據(jù)標(biāo)示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再量

32、取適量稀釋至規(guī)定濃度。注意點(diǎn)：研磨時(shí)應(yīng)注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內(nèi)含輔料較多，輔料可能漂浮于溶液表面，稀釋時(shí)量取供試溶液應(yīng)讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應(yīng)加以注意。為節(jié)約供試品，可與重量差異檢查結(jié)合進(jìn)行。糖衣片、腸溶片 取標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的片數(shù)，置于乳缽中，研細(xì)，分次加入規(guī)定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉(zhuǎn)移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據(jù)供試品標(biāo)示量、所取片數(shù)及抗生素儲(chǔ)備液濃度（一般為1000U/ml）選定，用規(guī)定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內(nèi)，精密吸取量瓶中的上層液適量，

33、作進(jìn)一步稀釋。個(gè)別品種標(biāo)準(zhǔn)如同時(shí)收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規(guī)定薄膜衣片也取整片制備供試溶液。 膠囊劑 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混合均勻，研細(xì)，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當(dāng)于!粒膠囊的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲(chǔ)備液濃度等計(jì)算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項(xiàng)下的方法進(jìn)行。 顆粒劑、干混懸劑 取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，混勻，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當(dāng)于1袋（包）的量或按標(biāo)示量、量瓶體積及抗生素儲(chǔ)備液濃度等計(jì)算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測(cè)得效價(jià)后，再根據(jù)裝量差異項(xiàng)下的平均裝量

34、，計(jì)算出平均每袋（包）的效價(jià)，根據(jù)標(biāo)示量即可算出含量。 軟膏劑、眼膏劑 擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開封口，置于干燥器內(nèi)約1h，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內(nèi)容物在天平上稱重，取出，將內(nèi)容物擠入分液漏斗，量約2g，再稱取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱量之差計(jì)算分液漏斗內(nèi)膏劑供試品的量，以不含過(guò)氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質(zhì)，但基質(zhì)中的抗生素則應(yīng)不溶于或幾乎不溶于該有機(jī)溶劑中，以避免提取過(guò)程中抗生素的損失。按標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解，用規(guī)定的緩沖溶液提取抗生素至水相中，用緩沖溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，搖

35、勻，量取適量稀釋至規(guī)定的濃度，滴加雙碟，培養(yǎng)，測(cè)量抑菌圈，數(shù)據(jù)處理，可靠性測(cè)驗(yàn)及可信限率判斷，計(jì)算效價(jià)?？股匚⑸锉葷岱?0 環(huán)境、儀器與用具10.1 操作室 要求同管碟法。10.2 儀器 可采用自動(dòng)濁度測(cè)定儀或分光光度計(jì)。 自動(dòng)濁度測(cè)定儀 主要由光源、樣品室、檢測(cè)器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。.1 環(huán)境條件 防止強(qiáng)光照射，儀器應(yīng)平穩(wěn)放置在工作臺(tái)上，便于操作，周圍無(wú)強(qiáng)烈的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和電磁干擾。.2 儀器使用前，應(yīng)預(yù)先穩(wěn)定23h后，再進(jìn)行測(cè)量。.3 吸收池 應(yīng)使用容量在15ml左右的石英吸收池。當(dāng)吸收池中裝入蒸餾水，在530nm、580nm、650nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸收池的吸光度，

36、差異應(yīng)不大于0.005。.4 溫度準(zhǔn)確度 實(shí)測(cè)溫度與設(shè)定溫度差異在±0.1內(nèi)。實(shí)測(cè)溫度與設(shè)定溫度30min內(nèi)漂移偏差應(yīng)在±0.1內(nèi)。測(cè)定樣品室4個(gè)不同位置處的溫度，差異應(yīng)在±內(nèi)。.5 波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的允差范圍在530nm、580nm、650nm波長(zhǎng)處，允許誤差在±2.0nm。.6 攪拌控制 各吸收池應(yīng)配有轉(zhuǎn)子攪拌裝置，攪拌部分應(yīng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，攪拌速度均勻。.7 濁度測(cè)定儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)和測(cè)量方式，其光源分為單通道光源和多通道光源兩類。對(duì)于多通道光源，在530nm、580nm、650nm波長(zhǎng)處測(cè)定國(guó)家計(jì)量認(rèn)可的濾光片的吸光度，不同通道光源間的差異應(yīng)不大于0.003。.

37、8 重復(fù)性 在530nm、580nm、650nm波長(zhǎng)處測(cè)定濾光片的吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，差異應(yīng)不大于0.005。.9 在530nm、580nm、650nm波長(zhǎng)處測(cè)定濾光片的吸光度，4h內(nèi)吸光度的差異應(yīng)不大于0.003。.10 吸收池應(yīng)采用隨機(jī)區(qū)組或其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法排列放置，以消除支間測(cè)定差異的影響。.11 樣品測(cè)定時(shí)，應(yīng)放置1個(gè)陰性管和1個(gè)陽(yáng)性管。測(cè)定儀的吸光度測(cè)定應(yīng)帶有自動(dòng)扣除陰性空白的功能。實(shí)驗(yàn)報(bào)告出具標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的吸光度和統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果外，還應(yīng)提供陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)曲線，各管的培養(yǎng)基終止時(shí)間應(yīng)處于實(shí)驗(yàn)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)。根據(jù)陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)曲線，如陽(yáng)性菌生長(zhǎng)不佳，則實(shí)驗(yàn)不成立，應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)。 分光光度計(jì)

38、 應(yīng)有數(shù)字顯示功能和自動(dòng)記錄裝置，數(shù)顯精度應(yīng)在小數(shù)點(diǎn)后三位。其各項(xiàng)指標(biāo)應(yīng)符合紫外-可見分光光度計(jì)的檢定規(guī)程。.1 玻璃大試管 20.5mm×2.5mm或適宜的試管，應(yīng)大小一致，厚薄均勻，玻璃質(zhì)地相同，使用同一品牌和批號(hào)。使用過(guò)的試管經(jīng)滅菌后，將培養(yǎng)基傾出，用水清洗，瀝干，再用硫酸-重鉻酸鉀洗液浸泡，清水沖洗干凈后，晾干，在160干烤23h滅菌，保持潔凈，備用。注意避免污染毛點(diǎn)、纖維等，以免干擾測(cè)定結(jié)果。.2 移液管 10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗（大），以便快速分裝培養(yǎng)基。.3 恒溫水浴箱 工作體積600mm×300mm×150mm（長(zhǎng)×寬

39、15;高），電熱恒溫水浴。.4 電動(dòng)攪拌器 將二臺(tái)電動(dòng)攪拌器的漿葉置于恒溫水浴的大試管隨機(jī)區(qū)組培養(yǎng)方列的兩側(cè)，于水中攪動(dòng)，以使水溫均勻。本身帶有攪拌或循環(huán)水系統(tǒng)的恒溫水浴箱，可不再配備電動(dòng)攪拌器。.5 分光光度計(jì)用吸收池 方形玻璃吸收池或石英吸收池，用硝酸-硫酸混合液（取濃硫酸95ml，加濃硝酸35ml，混勻）浸泡148h（浸泡時(shí)間視是否能去除附著污物而定），先后用水、去離子水（蒸餾水）沖洗干凈，晾干，備用。如仍不能除去附著污物，可用2%硝酸鈉的濃硫酸溶液浸泡后，再經(jīng)水洗滌。.6 其他 分析天平、稱量瓶、量瓶、25ml及50ml滴定管、秒表、濾紙及鏡頭紙等。11 試液 除同管碟法的要求外，比濁

40、法用的緩沖液應(yīng)澄清無(wú)色。緩沖液配制后用垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前滅菌。12 培養(yǎng)基 除同管碟法的要求外，比濁法使用的培養(yǎng)基應(yīng)澄明，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)后培養(yǎng)基本身不得出現(xiàn)渾濁。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后不得發(fā)生沉淀。根據(jù)這一原則，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基原材料的預(yù)試，挑選合適品牌廠家的產(chǎn)品使用。目前，已有一些種類的市售干燥培養(yǎng)基，如營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基等，使用方便。13 試驗(yàn)用菌液13.1 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)懸液 取金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在3537培養(yǎng)2022h。臨用時(shí)

41、，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。13.2 大腸桿菌(Escherichia coli)懸液 取大腸桿菌CMCC(B)44 103的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在3537培養(yǎng)2022h。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。13.3 白色念珠菌(Candida albicans)懸液 取白色念珠菌CMCC(F)98 001的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于100ml培養(yǎng)基（中國(guó)藥典2010年版二部附錄 A抗生素微生物檢定法）中，在3537培養(yǎng)8h。再用培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度，備用。14 操作方法14.1 稱量 要求同管碟法。14.2 稀釋 標(biāo)準(zhǔn)晶與供試品溶液

42、的稀釋應(yīng)使用經(jīng)標(biāo)定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。14.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 按中國(guó)藥典該品種含量測(cè)定項(xiàng)下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)晶貯備液。在該品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標(biāo)準(zhǔn)晶溶液選擇5個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（通常為1:1.25或更?。?供試品溶液 根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)晶溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3個(gè)試管。 含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（3537培養(yǎng)34h后測(cè)定的吸光度在0.30.7之間），加入到各液體培養(yǎng)基管中，混合均勻，使在試驗(yàn)條件下能得到滿意

43、的劑量一反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度（吸光度）。含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基在配制后應(yīng)立即使用，必要時(shí)可適當(dāng)冷卻，以防止試驗(yàn)菌在培養(yǎng)前生長(zhǎng)。 線性試驗(yàn) 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個(gè)試管內(nèi)分別精密加入各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各個(gè)試驗(yàn)管放置于恒溫水浴內(nèi)，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)（通常約4h）至適宜測(cè)量的濁度值（吸光度值）。各濃度不少于4個(gè)試管。14.4 平行線測(cè)定法二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 按中國(guó)藥典該品種含量測(cè)定項(xiàng)下的要求，制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)晶貯備液。在該品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，選擇2

44、個(gè)或3個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（二劑量通常為2:1或4:1，三劑量通常為1:0.8）。 供試品溶液 根據(jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量，取供試品按標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法，選擇2個(gè)或3個(gè)劑量。 含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備 同配制方法。 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品測(cè)定 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個(gè)試管內(nèi)分別精密加入2個(gè)或3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測(cè)量的濁度值（通常約為4h）。各濃度不少于4個(gè)試管。14.5 空白試驗(yàn) 另取2支試管各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，其中在一支

45、試管中立即加入12%甲醛溶液0.5ml，混勻，作為空白對(duì)照，另一支試管同法培養(yǎng)作為試驗(yàn)菌生長(zhǎng)對(duì)照。14.6 吸光度的測(cè)量 在線測(cè)定各試管的吸光度，或取出試管立即加入12%甲醛溶液 0.5ml以終止微生物的生長(zhǎng)，在530nm或580nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度。14.7 培養(yǎng)時(shí)間 觀察試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)曲線，測(cè)定時(shí)間應(yīng)處在試驗(yàn)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，且測(cè)定的吸光度應(yīng)在0.30.7之間。另外，還可以考慮吸光度-供試品濃度（對(duì)數(shù)值）的反應(yīng)曲線，如較平坦，可考慮選擇不同的培養(yǎng)時(shí)間，如反應(yīng)曲線斜率增加，則可增高實(shí)驗(yàn)的靈敏度。一般培養(yǎng)時(shí)間為34h。測(cè)定效價(jià)時(shí)，選擇一個(gè)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的吸光度即可。15 記錄與計(jì)算15.1 試驗(yàn)記錄要求與管碟法相同。15.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 效價(jià)計(jì)算 按下式計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率