絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備

1、項目四 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備姓名：吳彩霞姓名：吳彩霞班級：生藥班級：生藥1313組別：第組別：第1組組學(xué)號：學(xué)號：2013040930指導(dǎo)老師：彭加平指導(dǎo)老師：彭加平 韋平和韋平和 王芳王芳一背景知識 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMTSHMT）在自然界中普遍存在，它的生）在自然界中普遍存在，它的生理學(xué)功能是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆的互換。理學(xué)功能是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆的互換。 SHMTSHMT的催化反應(yīng)是氨基酸和核酸代謝的連接點，在氨基酸的的催化反應(yīng)是氨基酸和核酸代謝的連接點，在氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)和植物的光呼吸過程中，工業(yè)生產(chǎn)和植物的光呼吸過程中，SHMTSHMT

2、也是一個關(guān)鍵酶。也是一個關(guān)鍵酶。 L-L-絲氨酸是氨基酸輸液的重要成分絲氨酸是氨基酸輸液的重要成分, ,化妝品的添加劑化妝品的添加劑, ,酶法生酶法生產(chǎn)色氨酸的前體物質(zhì)。產(chǎn)色氨酸的前體物質(zhì)。L-L-絲氨酸在體內(nèi)代謝速度極快絲氨酸在體內(nèi)代謝速度極快. .因此因此, ,直接發(fā)酵生產(chǎn)很困難直接發(fā)酵生產(chǎn)很困難. . 酶法合成酶法合成L-L-絲氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特異的合成絲氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特異的合成L-L-絲氨絲氨酸酸, ,具有原料來源方便具有原料來源方便, ,原料成本低和可合成高濃度產(chǎn)品等優(yōu)原料成本低和可合成高濃度產(chǎn)品等優(yōu)點點, ,因此是最有前景的因此是最有前景的L-L-絲氨酸生產(chǎn)方法絲

3、氨酸生產(chǎn)方法. .231 1、電泳是指帶電顆粒在電場中將受到電場力的作、電泳是指帶電顆粒在電場中將受到電場力的作用而發(fā)生泳動。用而發(fā)生泳動。2 2、這種特性，用電泳的方法對這些物質(zhì)進(jìn)行定性、這種特性，用電泳的方法對這些物質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析，也可用于混合物的分離及定量分析，也可用于混合物的分離3 3、凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，、凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法4按分離原理：按分離原理：區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳4 4種種區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：電泳過程

4、中，不同的離子成分在均一的緩沖液中電泳過程中，不同的離子成分在均一的緩沖液中 分離成獨立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。分離成獨立的區(qū)帶，這是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的電泳技術(shù)。區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳分類：分類：按支持物物理性狀分類按支持物物理性狀分類 1. 1. 濾紙及其他纖維素膜電泳。濾紙及其他纖維素膜電泳。 2. 2. 粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。 3. 3. 凝膠電泳凝膠電泳，如瓊脂糖、淀粉膠、，如瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳。 4. 4. 絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。按支持物的裝置形

5、式不同分類按支持物的裝置形式不同分類 1. 1. 平板式電泳平板式電泳2.2. 垂直板式電泳。垂直板式電泳。3. 3. 連續(xù)流動電泳連續(xù)流動電泳按按pHpH的連續(xù)性不同分類的連續(xù)性不同分類1. 1. 連續(xù)連續(xù)pHpH電泳：電泳全部過程中緩沖液電泳：電泳全部過程中緩沖液pHpH保持不變。保持不變。 2 2、不連續(xù)、不連續(xù)pHpH電泳電泳電泳技術(shù)的分類5凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳幾乎所有幾乎所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行所有條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并盡可能減少所有條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間

6、的聚集，最常用的就是其相互間的聚集，最常用的就是SDSPAGE電泳技術(shù)電泳技術(shù)SDSPAGE電泳可用電泳可用圓圓盤盤和和垂直平板電泳的形式，原理相同，垂直平板電泳的形式，原理相同，步驟也大致相同。步驟也大致相同。SDSPAGE電泳亦分為不連續(xù)系統(tǒng)和連續(xù)系統(tǒng)。電泳亦分為不連續(xù)系統(tǒng)和連續(xù)系統(tǒng)。本實驗采用垂直平板以不連續(xù)系統(tǒng)的本實驗采用垂直平板以不連續(xù)系統(tǒng)的SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠方式進(jìn)行電泳。方式進(jìn)行電泳。垂直平板電泳的優(yōu)點在于在一塊凝膠平板上可以同時進(jìn)行不垂直平板電泳的優(yōu)點在于在一塊凝膠平板上可以同時進(jìn)行不同樣品的電泳。因此條件一致，更加便于比較。同樣品的電泳。因此條件一致，更加便于比

7、較。6二、二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳這種凝膠由丙烯酰胺（這種凝膠由丙烯酰胺（acrylamideacrylamide，簡稱，簡稱AcrAcr）和交聯(lián)劑）和交聯(lián)劑N N，N-N-甲叉基（亞甲基）雙丙烯酰胺（甲叉基（亞甲基）雙丙烯酰胺（N N，N-methylene-bis-N-methylene-bis-acrylamideac

8、rylamide，簡稱，簡稱Bis)Bis)聚合而成。聚合而成。PAGEPAGE電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)分子（或其它生物大分子）所帶電荷的差電泳是根據(jù)蛋白質(zhì)分子（或其它生物大分子）所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率而分離成若干條區(qū)帶。異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率而分離成若干條區(qū)帶。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，透明，化學(xué)穩(wěn)定性高，聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，彈性大，透明，化學(xué)穩(wěn)定性高，無電滲作用，設(shè)備簡單，用樣量少（無電滲作用，設(shè)備簡單，用樣量少（1-100g1-100g）和分辨率高等優(yōu)）和分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成孔徑大點，并可通過

9、控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成孔徑大小不同的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分離、定性和定量小不同的凝膠，可用于蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分離、定性和定量分析。還可結(jié)合去垢劑十二烷基硫酸鈉（分析。還可結(jié)合去垢劑十二烷基硫酸鈉（SDSSDS），以測定蛋白質(zhì)亞），以測定蛋白質(zhì)亞基分子量?；肿恿俊?三、三、實驗原理實驗原理1 1、帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種、帶電質(zhì)點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳?，F(xiàn)象稱為電泳。2、蛋白質(zhì)分子是兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)分子是兩性電解質(zhì)，pHpI時該蛋白質(zhì)帶負(fù)電時該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，反之荷，反之pHpI時該蛋白質(zhì)帶正電荷。時該蛋白質(zhì)帶

10、正電荷。3 3、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)中引進(jìn)SDSSDS（十二烷基磺酸鈉），（十二烷基磺酸鈉）， SDS SDS能斷裂分子內(nèi)和分能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的有強(qiáng)還原劑的SDSSDS溶液中，與溶液中，與SDSSDS分子按比例結(jié)合，形成分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的帶負(fù)電荷的SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大蛋

11、白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的量的SDSSDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDSSDS與蛋白質(zhì)的與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。子的遷移速度取決于分子大小。8三、三、實驗原理實驗原理 4. 4. 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在150001500020000020

12、0000之間時，之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)值呈直線關(guān)系，符合電泳遷移率與分子量的對數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程：下列方程： 1gMr = 1gMr =K KbmRbmR 式中：式中：MrMr為蛋白質(zhì)的分子量；為蛋白質(zhì)的分子量；K K為常數(shù)；為常數(shù)；b b為斜率；為斜率；mRmR為相對遷移率。在條件一定時，為相對遷移率。在條件一定時，b b和和K K均為常數(shù)。均為常數(shù)。 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)的對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即在相同條件下

13、進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量?？稍跇?biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。95 5、聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提、聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；6 6、TEMEDTEMED與與APAP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；APAP中含有中含有2929的丙烯酰胺和的丙烯酰胺和1 1的甲叉基聚丙烯酰胺，能的甲叉基聚丙烯酰胺，能產(chǎn)生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。產(chǎn)生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。7 7、十二烷基

14、硫酸鈉（、十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）：陽離子去污劑，作用）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。三、三、實驗原理實驗原理AP是是過硫酸銨過硫酸銨10夾心垂直板電泳槽示意圖 1.樣品槽模板 2.長玻璃板 3.凹形橡膠框 4.樣品槽模板 5.固定螺絲 6.上貯槽 7.冷凝系統(tǒng) 1112四、四、儀器、原料和試劑儀器：垂直板型電泳槽；天平；直流穩(wěn)壓電源；儀器：垂直板型電泳槽；天平；直流穩(wěn)壓電源；5050或或100l100l微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；

15、燒杯；微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯；吸量管；常頭滴管等。吸量管；常頭滴管等。原料：原料：SHMTSHMT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0.51mgml-10.51mgml-1樣樣品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。試劑：試劑： （1 1）分離膠緩沖液（）分離膠緩沖液（Tris-HClTris-HCl緩沖液緩沖液 PH8.9 PH8.9）: :取取1mol/L1mol/L鹽酸鹽酸48mL48mL，Tris 36.3g,Tris 36.3g,用無離子水溶解后定容用無離子水溶解后

16、定容至至100mL100mL。 （2 2）濃縮膠緩沖液（）濃縮膠緩沖液（Tris-HClTris-HCl緩沖液緩沖液 PH6.7 PH6.7）: :取取1mol/L1mol/L鹽酸鹽酸48mL, Tris 5.98g,48mL, Tris 5.98g,用無離子水溶解后定容用無離子水溶解后定容至至100mL100mL。 （3 3）30%30%分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺（烯酰胺（AcrAcr） 30g30g及及N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（BisBis）0.8g0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至，溶于重蒸水中，最后定容至

17、100ml100ml，過濾后置棕色，過濾后置棕色試劑瓶中，試劑瓶中，44保存。保存。 （4 4）10%10%濃縮膠貯液：稱濃縮膠貯液：稱Acr 10gAcr 10g及及Bis 0.5gBis 0.5g，溶于重，溶于重蒸水中，最后定容至蒸水中，最后定容至100mL100mL，過濾后置棕色試劑瓶中，過濾后置棕色試劑瓶中，44貯存。貯存。 （5 5）10%SDS10%SDS溶液：溶液：SDSSDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。使其完全溶解。 （6 6）1%TEMED1%TEMED；13四、四、儀器、原料和試劑 （7 7）10%10%過硫酸銨（過硫酸銨（APAP

18、）：現(xiàn)用現(xiàn)配。）：現(xiàn)用現(xiàn)配。 （8 8）電泳緩沖液（）電泳緩沖液（Tris-Tris-甘氨酸緩沖液甘氨酸緩沖液PH8.3PH8.3）: :稱取稱取Tris 6.0g, Tris 6.0g, 甘氨酸甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 28.8g, SDS 1.0g, 用無用無離子水溶解后定容至離子水溶解后定容至1L1L。（9 9）樣品溶解液：取）樣品溶解液：取SDS 100mgSDS 100mg，巰基乙醇，巰基乙醇0.1mL0.1mL，甘油甘油1mL1mL，溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)2mg2mg，0.2mol/L0.2mol/L，pH7.2pH7.2磷酸緩磷酸緩沖液沖液0.5mL0.5mL，加重蒸水至，

19、加重蒸水至10mL10mL（遇液體樣品濃度增（遇液體樣品濃度增加一倍配制）。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測固體。加一倍配制）。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測固體。（1010）染色液：）染色液：0.25g0.25g考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250G-250，加入，加入454mL 50%454mL 50%甲醇溶液和甲醇溶液和46mL46mL冰乙酸即可。冰乙酸即可。（1111）脫色液：）脫色液：75mL75mL冰乙酸，冰乙酸，875mL875mL重蒸水與重蒸水與50mL50mL甲醇混勻。甲醇混勻。14四、四、儀器、原料和試劑五、實驗步驟15安裝電泳槽安裝電泳槽凝膠制備凝膠制備樣品處理與加樣樣品處理與加樣電泳電泳剝

20、膠與固定剝膠與固定染色與脫色染色與脫色五、實驗步驟1 1、安裝夾心式垂直板電泳槽：安裝前，膠條、玻板、槽子都要、安裝夾心式垂直板電泳槽：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；潔凈干燥；裝上貯槽和固定螺絲釘，仰放在桌面上。裝上貯槽和固定螺絲釘，仰放在桌面上。將長、短玻璃板分別插到硅橡膠框的凹形槽中，勿用手接觸將長、短玻璃板分別插到硅橡膠框的凹形槽中，勿用手接觸灌膠面的玻璃。灌膠面的玻璃。將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。上貯槽。將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)以裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)以裝好螺絲釘?shù)纳腺A槽，

21、雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。的方式旋緊螺絲帽。豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的已融化的1%1%瓊脂，以封住空隙，加瓊脂溶液時，應(yīng)防止氣泡瓊脂，以封住空隙，加瓊脂溶液時，應(yīng)防止氣泡進(jìn)入。進(jìn)入。161718 3 3制備凝膠板：制備凝膠板：（1 1）分離膠制備：按表配制）分離膠制備：按表配制20ml 10%20ml 10%分離膠，混勻后用細(xì)分離膠，混勻后用細(xì)長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約長頭滴管將凝膠液加至長、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，約8cm8cm高，用高，用1ml1ml注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩

22、慢注注射器取少許蒸餾水，沿長玻璃板板壁緩慢注入，約入，約34mm34mm高，以進(jìn)行水封。約高，以進(jìn)行水封。約30min30min后，凝膠與水封后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。（2 2）濃縮膠的制備：按表配制）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3%10ml 3%濃縮膠，混勻后用細(xì)濃縮膠，混勻后用細(xì)長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約玻璃板上緣約0.5cm0.5cm

23、處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約避免帶入氣泡。約30min30min后凝膠聚合，再放置后凝膠聚合，再放置2030min2030min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短板約下貯槽中，應(yīng)沒過短板約0.5cm0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。以上，即可準(zhǔn)備加樣。 19 4 4樣品處理及加樣樣品處理及加樣 各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，使

24、各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹闈舛葹?.51mg/mL0.51mg/mL，沸水浴加熱，沸水浴加熱3 3分鐘，冷卻至室分鐘，冷卻至室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱應(yīng)在沸水浴中加熱1 1分鐘，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。分鐘，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。一般加樣體積為一般加樣體積為101015L15L（即（即2 210g10g蛋白質(zhì)）。蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，心將樣品通過緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都

25、加了樣品，即可開始電泳。待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。20 5 5電泳電泳 將直流穩(wěn)壓電泳儀開關(guān)打開，開始時將電流調(diào)至將直流穩(wěn)壓電泳儀開關(guān)打開，開始時將電流調(diào)至10mA10mA。待樣品進(jìn)入分離較時，將電流調(diào)至。待樣品進(jìn)入分離較時，將電流調(diào)至202030 30 mAmA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至底部時，將電流調(diào)回到零，。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至底部時，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕關(guān)閉電源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作輕將一塊玻璃撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色

26、。 6 6染色及脫色染色及脫色 將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色1h1h左右，用蒸餾水左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰，漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白區(qū)帶清晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。21大分子大分子小小分分子子緩沖液緩沖液小分子走在前頭，大分子滯后小分子走在前頭，大分子滯后2223結(jié)果分析結(jié)果分析24 相對遷移率相對遷移率mR =mR =樣品遷移距離（樣品遷移距離（cmcm）/ /染料染料遷移距離（遷移距離（cmcm）計算計算25知識補(bǔ)充知識補(bǔ)充SDS-PAGESDS-PAGE電泳過程中影

27、響結(jié)果的因素：電泳過程中影響結(jié)果的因素：1. 1. 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？ 在在SDSSDSPAGEPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisTrisHCLHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7pH6.7，分離膠，分離膠pH8.9pH8.9；而電泳緩；而電泳緩沖液使用的沖液使用的TrisTris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pHpH環(huán)環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而泳動效率低；而CLCL離子卻很高

28、，兩者之間形成導(dǎo)電性較低離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中入分離膠后，由于膠中pHpH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子

29、根據(jù)其固有的膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。帶電性和分子大小進(jìn)行分離。 所以，所以，pHpH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。慮該因素。 26 2. 2. 樣品如何處理？樣品如何處理？ 根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDSSDS處理、非還原處理、非還原SDSSDS處理、帶有烷基化作用的還原處理、帶有烷基化作用的還原SDSSDS處理。

30、處理。 1 1）還原）還原SDSSDS處理：在上樣處理：在上樣bufferbuffer中加入中加入SDSSDS和和DTTDTT（或（或BetaBeta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDSSDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣入上樣BufferBuffer，離心，沸水煮，離心，沸水煮5min5min，再離心加樣。，再離心加樣。 2 2）帶有烷基化作用的還原）帶有烷基化

31、作用的還原SDSSDS處理：碘乙酸胺的烷基化作處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SHSH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的另碘乙酸胺可捕集過量的DTTDTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul100ul樣品緩沖液中樣品緩沖液中10ul 2010ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min30min。 27 3. SDS-PAGE3. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？電泳凝膠中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，聚丙烯酰胺的

32、作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；密切相關(guān)； 制膠緩沖液：濃縮膠選擇制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7pH6.7，分離膠選擇，分離膠選擇pH8.9pH8.9，選擇，選擇tristrisHCLHCL系統(tǒng)，系統(tǒng)，TEMEDTEMED與與APAP：APAP提供自由基，提供自由基，TEMEDTEMED是催是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基硫酸鈉化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解）：陽離子去污劑，作用有四：

33、去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。肽折疊。 4. 4. 提高提高SDS-PAGESDS-PAGE電泳分辨率的途徑？電泳分辨率的途徑？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或即配即用或4 4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致可導(dǎo)致SDSSDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存結(jié)晶。一般凝膠可在

34、室溫下保存4 4天，天，SDSSDS可水可水解聚丙烯酰胺。解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法同染料又各自不同的染色方法28 5.“ 5.“ 微笑微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ 主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。 6. “6. “皺眉皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？（兩邊向下中間鼓起）形帶

35、原因？ 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 7. 7. 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？ 主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠

36、濃度。濃度。 8. 8. 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。29 9. 9. 什么是什么是“鬼帶鬼帶”，如何處理？，如何處理？ “鬼帶鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來

37、被解離的蛋白質(zhì)分子重新折被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在同的免疫學(xué)活性，在WBWB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用?？贵w作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTTDTT或或BetaBeta巰基巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTAEDTA來阻止還原來阻止還原劑的氧化。劑的氧化。 10. 10. 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 我們在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還我們在實驗中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 處理辦法：更換正確處理辦法：更換正確pHpH值的值的BufferBuffer；降低分離膠的濃度。；降低分離膠的濃度。 11. 11. 為什么電泳