超速離心-高效液相色譜測定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白膽固

1、超速離心超速離心-高效液相色譜測定血清高密度脂蛋白高效液相色譜測定血清高密度脂蛋白 和低密度脂蛋白膽固醇：一種候選參考方法和低密度脂蛋白膽固醇：一種候選參考方法 董軍董軍 國漢邦國漢邦 陳文祥陳文祥衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所 HDL-C HDL-C降低降低 和和LDL-CLDL-C升高，是明確的心血管病獨立危險因素升高，是明確的心血管病獨立危險因素 心血管病防治工作需要準確的心血管病防治工作需要準確的HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C測定結(jié)果測定結(jié)果 建立和保證建立和保證HDL-CHDL-C和和LDL-CLDL-C常規(guī)測定結(jié)果的準確性需要常規(guī)測定結(jié)果的準確性需要 可靠的

2、參考方法可靠的參考方法HDL-C HDL-C 和和LDL-CLDL-C準確測定準確測定 必要性必要性美國疾病控制與預(yù)防中心美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC) 定量法定量法 D=1.006 超速離心分離極低密度脂蛋白（超速離心分離極低密度脂蛋白（VLDL），），制備底部組分（制備底部組分（BF）( 包括包括IDL, LDL, HDL和和Lp(a)等）等）用肝素用肝素-錳離子試劑沉淀錳離子試劑沉淀BF中的中的 脂蛋白，制備脂蛋白，制備HDL組分組分分別用分別用AK膽固醇參考方法測定膽固醇參考方法測定BF 膽固醇膽固醇(BFC)和和HDLC，自自BFC中減去中減去HDLC得得LDL-C (包括包括ID

3、L和和Lp(a) 樣品量大樣品量大(5 mL)，其應(yīng)用受到可得樣品量限制，其應(yīng)用受到可得樣品量限制 LDL和和HDL的分離采用化學(xué)沉淀法，影響因素較多的分離采用化學(xué)沉淀法，影響因素較多 樣品制備需多部手工容量操作，費時，技術(shù)要求高樣品制備需多部手工容量操作，費時，技術(shù)要求高 受超速離心轉(zhuǎn)頭品種的限制，每次分析最多受超速離心轉(zhuǎn)頭品種的限制，每次分析最多18 個樣品個樣品 由于脂蛋白的不穩(wěn)定性，樣品制備過程（約需由于脂蛋白的不穩(wěn)定性，樣品制備過程（約需24-28小時）小時） 本身造成本身造成HDL-C和和LDL-C的變化的變化 -定量法存在的問題定量法存在的問題血清脂蛋白膽固醇的體外再分布血清脂蛋

4、白膽固醇的體外再分布 超速離心法超速離心法: 各類脂蛋白的定義方法，在分析化學(xué)上可能各類脂蛋白的定義方法，在分析化學(xué)上可能 也是最可靠的脂蛋白分離方法，是一種物理分離方法，也是最可靠的脂蛋白分離方法，是一種物理分離方法， 影響因素最少。影響因素最少。 電泳法電泳法: 很難用于精密脂蛋白分析。很難用于精密脂蛋白分析。 沉淀法沉淀法: 沉淀劑和沉淀條件多種多樣，影響因素多，沉淀劑和沉淀條件多種多樣，影響因素多， 較難實現(xiàn)一致的特異性。較難實現(xiàn)一致的特異性。脂蛋白的分離方法脂蛋白的分離方法 超速離心中的定量操作困難、繁瑣，樣品量大超速離心中的定量操作困難、繁瑣，樣品量大 部分部分Lp(a)在在HDL

5、密度范圍內(nèi)，造成密度范圍內(nèi)，造成HDL測定偏差測定偏差超速離心法（結(jié)合精密膽固醇分析）超速離心法（結(jié)合精密膽固醇分析） 參考方法參考方法(2)18385878981180.95 0.96 0.97 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 1.18 1.19 1.20 1.21血清脂蛋白的密度分布血清脂蛋白的密度分布LDLHDLVLDLLp(a) Lp(a)是二硫鍵連接的是二硫鍵連接的LDL-apo(a)復(fù)和體，還原劑復(fù)和體，還原劑 可使

6、可使Lp(a)解離為解離為LDLLp(a-)和和apo(a). Lp(a-)密度與密度與LDL相近，或略小于相近，或略小于LDL. 若能建立條件，使若能建立條件，使Lp(a)解離，又不改變解離，又不改變HDL的密度的密度 性質(zhì)，則可實現(xiàn)性質(zhì)，則可實現(xiàn)HDL的超速離心分離的超速離心分離.Lp(a) LDL-apo(a)復(fù)合體復(fù)合體0.020.040.060.080.0100.0120.0140.0160.0180.00.9801.0001.0201.0401.0601.0801.1001.1201.140DensityChol (mg/dl)EGME不同密度下不同密度下ME對超速離心對超速離心B

7、FC的影響的影響(2)18385878981180.95 0.96 0.97 0.98 0.99 1.00 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.10 1.11 1.12 1.13 1.14 1.15 1.16 1.17 1.18 1.19 1.20 1.21(lp(a),me-)all,me-(lp(a),me)all,meME對血清脂蛋白密度的影響對血清脂蛋白密度的影響1.31.41.51.60.000.020.040.060.080.10ME (mol/L)BFC (mmol/L)樣品溶液中樣品溶液中ME濃度對濃度對1.063密度下

8、超速離心密度下超速離心BFC的影響的影響 取來自不同個體的血清取來自不同個體的血清49 份份 在在1.063背景密度及背景密度及ME（0.05 mol/L）存在和不存在下）存在和不存在下 超速離心，測定超速離心，測定BFC（BFC1.063ME(+)和和BFC1.063ME(-)） 用免疫比濁法測定用免疫比濁法測定Lp(a)質(zhì)量質(zhì)量 用用DCM測定測定HDLC（HDLCDCM）ME 解離解離Lp(a) 有效性有效性0.000.050.100.150.200.250.30010203040506070Lp(a) (mg/dl)BFC1.063-BFC1.063ME (mmol/L)BFC1.06

9、3ME(-)與與BFC1.063ME(+)之差與之差與Lp(a)的關(guān)系的關(guān)系 (r=0.848)0.000.050.100.150.200.250.300.00.51.01.52.02.5BFC1.063MEBFC1.063-BFC1.063ME (mmol/L)BFC1.063ME(-)與與BFC1.063ME(+)之差與之差與HDLC的關(guān)系的關(guān)系 ( r=0.093,)bias vs lp(a)-pr(0.15)(0.10)(0.05)0.000.050.100.020.040.060.080.0 BFC1.063ME(+)與與 HDLCDCM之差與之差與Lp(a)的關(guān)系的關(guān)系 （r =

10、0.414, P0.05） 用ME使使 Lp(a) 解離為游離解離為游離apo(a)和和Lp(a)Lp(a-) 用脯氨酸解離用脯氨酸解離Lp(a)或或apo(a)與脂蛋白的可能非共價鍵結(jié)合與脂蛋白的可能非共價鍵結(jié)合 1.063密度下超速離心，將密度下超速離心，將HDL（BF1.063）與其他脂蛋白分離）與其他脂蛋白分離 1.006密度下超速離心，將密度下超速離心，將HDL和和LDL（BF1.006）與）與VLDL分離分離 用用HPLC測定測定BFC1.006和和BFC1.063 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063 (含含IDLC和和Lp(a)C

11、)方法原理方法原理超速離心密度液配制超速離心密度液配制:密度液密度液I: 含含0.1M脯氨酸的溴化鈉溶液，使密度為脯氨酸的溴化鈉溶液，使密度為1.006密度液密度液II: 含含0.1脯氨酸和脯氨酸和0.05M ME的溴化鈉溶液，調(diào)節(jié)溴的溴化鈉溶液，調(diào)節(jié)溴 化鈉濃度，使密度為化鈉濃度，使密度為1.0666 (兩種密度液（兩種密度液（0.8 ml）與血清（）與血清（0.05 ml）混合）混合 后分別給出背景密度后分別給出背景密度1.006 g/ml和和1.063 g/ml)標準溶液和內(nèi)標溶液配制標準溶液和內(nèi)標溶液配制:膽固醇乙醇溶液膽固醇乙醇溶液: 濃度濃度 0.646, 1.293, 2.586

12、 , 5.172 , 7.758 mmol/L豆甾醇乙醇溶液豆甾醇乙醇溶液: 濃度濃度5.17 mmol/L，作內(nèi)標溶液，作內(nèi)標溶液密度液及標準溶液配制密度液及標準溶液配制樣品制備樣品制備: 用稀釋器的稀釋功能加入血清樣品用稀釋器的稀釋功能加入血清樣品(體積為體積為0.05ml)和和 稀釋劑（密度液稀釋劑（密度液, 體積為體積為0.8 ml) 超速離心條件超速離心條件: 20, 23000 rpm, 離心離心18.5 h離心管切割離心管切割: 用離心管切割器在離心管中液體的中間位置切割離心管，取下部用離心管切割器在離心管中液體的中間位置切割離心管，取下部 離心管，內(nèi)含離心管，內(nèi)含1.006 g

13、/ml背景密度下的背景密度下的BF（BF1.006）和）和1.063 g/ml 背景密度及背景密度及ME存在下的存在下的BF（BF1.063），進行膽固醇分析），進行膽固醇分析 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063超速離心分離脂蛋白組分超速離心分離脂蛋白組分高效液相色譜測定膽固醇高效液相色譜測定膽固醇 I 將內(nèi)含不同將內(nèi)含不同BF的下部離心管，置的下部離心管，置10-ml具蓋試管中具蓋試管中 標準溶液標準溶液0.05 ml，用，用0.5 ml乙醇沖入乙醇沖入10-ml具蓋試管中具蓋試管中 向各試管中加乙醇向各試管中加乙醇-8.9 mol/L氫氧化

14、鉀（氫氧化鉀（9:1）4 ml 各管加內(nèi)標各管加內(nèi)標0.05 ml，用，用0.5 ml乙醇沖入乙醇沖入10-ml具蓋試管中具蓋試管中 水平式振蕩器振蕩水平式振蕩器振蕩20 min 50 水解水解2h高效液相色譜測定膽固醇高效液相色譜測定膽固醇 II400ul Acetone20l, 4MH2SO4-4MCrO3vortex, RT 5min0.5ml Hexane, 0.5ml waterVortex, 5min200ul supernatant dry down for chromatography0.5ml 水解液水解液0.5mlH2O, 1mlHexaneVortex, 20min0.5

15、ml,Hexane, 揮干揮干高效液相色譜分離膽固醇和高效液相色譜分離膽固醇和6-氯豆甾醇氯豆甾醇0.51.01.52.02.50.51.01.52.02.5DCM HDLC (mmol/L)超速離心法超速離心法HDLC (mmol/L)超速離心法超速離心法HDLC(BFC1.063ME(+)與與 HDLC DCM的關(guān)系的關(guān)系 (r = 0.998)血清血清 平均值平均值 (mmol/L) 平均批內(nèi)平均批內(nèi)CV(%) 總總CV (%) HDLC LDLC HDLC LDLC HDLC LDLC1 1.342 2.897 0.67 0.48 0.96 1.122 2.202 2.778 0.60 0.78 1.01 0.923 1.292 4.148 0.91 0.45 1.73 0.654 0.880 2.874 1.21 0.68 2.07 0.82超速離心超速離心HPLC法測定血清法測定血清HDLC和和LDLC的精密度的精密度用超速離心法分離脂蛋白，所分離的脂蛋白與