19水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法

1、ICS67.120.30CCS B50DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 32/TXXXXXXXX水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法 Detection method for Vibrio parahaemolyticus in aquatic by real-time fluorescence recombinase-aid amplification20XX - XX - XX發(fā)布20XX - XX - XX實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB32/T XXXXXXXX前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件

2、由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出并歸口。本文件起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、江蘇省淡水水產(chǎn)研究所、上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心、南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、廣東省科學(xué)院微生物研究所、杭州傲敏生物科技有限公司。本文件主要起草人：薛峰、朱曉華、申進(jìn)玲、蔣原、張馳、薛亮、湯芳、戴建君、吳清平、梁瑩、任建鸞、趙凱穎、張正榮。5水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法1 范圍本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增（recombinase-aid Amplification，RAA）法的試劑材料、儀器設(shè)備、檢測(cè)程序、操作步驟、結(jié)果判定和報(bào)告、檢出限及防止污染措施。本文件適用

3、于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)。本文件適用于水產(chǎn)品副溶血性弧菌的快檢初篩。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.7 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB 19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T 27403 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測(cè)3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增 recombinase-aid Am

4、plification, RAA一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程，在恒溫下（一般為3742），進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)。4 原理RAA法利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程。根據(jù)副溶血性弧菌的特異性基因序列，結(jié)合熒光探針檢測(cè)法對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖及水體中副溶血性弧菌進(jìn)行判定。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增后，根據(jù)樣品在30 min內(nèi)是否出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，可判定樣品結(jié)果。5 試劑材料除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。試劑材料有：a) 探針和引物根據(jù)副溶血性弧菌的特異性基因

5、序列設(shè)計(jì)探針和引物。表1 副溶血性弧菌探針和引物致病菌種類引物探針名稱序列（5'-3'）目的基因副溶血性弧菌上游引物tlh-FTTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGtlh下游引物tlh-RAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAexo探針tlh-PTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCFAM-dTTHFABHQ-dTACAACCACACGAT-SpacerC3b) 試劑1） RAA反應(yīng)緩沖液：20% PEG，280 mmol/L醋酸鎂（MgAc2）。也可采用等效的商品試劑盒。2）凍干酶制劑：1 mmol/

6、L dNTP、90 ng/L單鏈結(jié)合蛋白、120 ng/L recA重組酶、30 ng/L Bsu DNA聚合酶、30 ng/L ExoIII、100 mmol/L Tricine、20% PEG、5 mmol/L 二硫蘇糖醇、100 ng/L肌酸激酶，保存于200 L反應(yīng)管中。也可采用等效的商品試劑盒。3）陽性對(duì)照：副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802，或含目的片段的DNA；陰性對(duì)照：非副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，或不含目的片段的DNA；空白對(duì)照：無菌水。6 儀器和設(shè)備包括以下幾種：a) 熒光檢測(cè)儀：帶有恒溫（39 ±1 ）擴(kuò)增功能的熒光檢測(cè)儀。b) 微量移液器：0.1 L2.5 L，

7、1 L10 L，2 L20 L，10 L100 L，20 L200 L，100 L1 000 L，并配備與移液器匹配的吸頭。c) 高速臺(tái)式離心機(jī)：離心力12000 g。d) 恒溫水浴鍋或金屬?。?00 ±1。e) 天平：感量0.01 g。7 檢測(cè)程序副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序見圖。圖1 副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序8 操作步驟8.1 樣品處理和增菌水產(chǎn)品參照GB 4789.7 執(zhí)行。8.2 細(xì)菌模板DNA的制備8.2.1 試劑盒法使用商品化DNA提取試劑盒，吸取適量獲得的增菌液，按其說明提取制備模板DNA。8.2.2 煮沸法8.2.2.1 吸取10.1獲得的增菌液1 m

8、L菌液加入1.5 mL離心管中，10000 g離心1 min，棄上清。8.2.2.2 加入1 mL 無菌水，充分懸浮沉淀，10000 g離心1 min，棄上清；8.2.2.3 加入100 L無菌水混勻后沸水浴（或95 金屬?。?0 min，置冰上冷卻； 8.2.2.4 10000 g離心1 min，上清液即為模板DNA。8.3 實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增8.3.1 實(shí)時(shí)熒光RAA反應(yīng)體系 副溶血性弧菌RAA檢測(cè)，50 L反應(yīng)體系見表2。表2 副溶血性弧菌熒光 RAA反應(yīng)體系組分名稱體積（µL）20% PEG12.5 µLtlh-F(10 µmol/L)2.1 µ

9、Ltlh-R(10 µmol/L)2.1 µLtlh-P(10 µmol/L)0.6 µLDNA模板（20 ng/µL）4.0 µLddH2O26.2 µLMgAc2（280 mmol/L）2.5 µL總量50 µL注：（1）DNA模板量可根據(jù)不同樣品，具體情況進(jìn)行調(diào)整。（2）將除MgAc2和模板DNA以外的所有成分渦旋混勻，分裝混合液至含有凍干酶制劑的200 µL反應(yīng)管中，輕柔手彈使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心，打開反應(yīng)單元，向每個(gè)反應(yīng)單元的管蓋上加入2.5 L MgAc2，然后向各反應(yīng)單元加

10、入適量模板DNA（100 ng），充分混勻并離心。（3）可使用等效的商品化熒光RAA試劑盒按照其說明書進(jìn)行檢測(cè)。8.4 反應(yīng)條件將反應(yīng)管置于熒光檢測(cè)儀中，39恒溫，30 min。在反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。8.5實(shí)驗(yàn)對(duì)照檢測(cè)過程中分別設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以無菌水替代模板DNA；陰性對(duì)照以非副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為模板DNA；陽性對(duì)照以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802 DNA作為模板DNA。 9 結(jié)果判定和報(bào)告9.1 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照在30 min內(nèi)無擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照在30 min內(nèi)無擴(kuò)增曲線；陽性對(duì)照在10 min內(nèi)出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無效，需重新進(jìn)行。9.2 結(jié)果判定樣品在30 min內(nèi)無擴(kuò)增曲線，可判定樣品結(jié)果為陰性，可直接報(bào)告未檢出副溶血性弧菌