蛋白質(zhì)分離技術(shù)

1、Release proteins from cells and Differential centrifugation as a first step in protein purificationn蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)與aaaa一樣，能夠發(fā)生兩性解離，一樣，能夠發(fā)生兩性解離，也有也有等電點(diǎn)等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時。在等電點(diǎn)時( (IsoelectricIsoelectric point point pIpI) )，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。電場中不移動。等電點(diǎn)測定等電點(diǎn)測定等電聚焦法（等電聚焦法（isoelectricfocusing）一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)n蛋

2、白質(zhì)的分子量很大（蛋白質(zhì)的分子量很大（1-1001-100nmnm），），在水溶液中在水溶液中具有膠體性質(zhì)，如布郎運(yùn)動、丁達(dá)爾現(xiàn)象具有膠體性質(zhì)，如布郎運(yùn)動、丁達(dá)爾現(xiàn)象不能不能通過半透膜通過半透膜等。等。透析：透析：將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋，置將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋，置水中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來，大分子蛋水中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來，大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。白質(zhì)仍留在袋中。半透膜：半透膜：只允許小分子通過，而大分子不能通過。只允許小分子通過，而大分子不能通過。如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等。如羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等。穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素

3、： A.A.蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成水化膜。蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成水化膜。 B.B.非等電狀態(tài)時，同種電荷的互相排斥。非等電狀態(tài)時，同種電荷的互相排斥。 蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)蛋白質(zhì)在溶液中靠水膜和電荷保持其穩(wěn)定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶定性，水膜和電荷一旦除去，蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會從溶液的穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)就會從溶液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為液中沉淀下來，此現(xiàn)象即為蛋白質(zhì)的沉蛋白質(zhì)的沉淀作用。淀作用。n在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過改變?nèi)芤旱膒HpH或電荷狀況，或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀分離使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀分離, , 沉淀過程中，蛋

4、沉淀過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，故這種沉淀又件下，可以重新溶解形成溶液，故這種沉淀又稱為稱為非變性沉淀或可逆沉淀。非變性沉淀或可逆沉淀。n可逆沉淀的方法可逆沉淀的方法: :等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。機(jī)溶劑沉淀法等。n由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為化，所以又稱為變性沉淀或不可逆沉淀。變性沉淀或不可逆沉淀。n如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀如加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀（HgHg2+2+、 Pb P

5、b2+2+ 、CuCu2+2+、 Ag Ag2+2+）和生物堿試劑或和生物堿試劑或某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。某些酸類沉淀等都屬于不可逆沉淀。 天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使天然蛋白質(zhì)因受物理、化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生了異常變化，從而導(dǎo)致生物活性的喪失。這種現(xiàn)象稱為生物活性的喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性( (denaturation)。a.a.蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)變性后的現(xiàn)象：蛋白質(zhì)變性后的現(xiàn)象：結(jié)晶及生物活性喪失。結(jié)晶及生物活性喪失。疏水側(cè)鏈基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散。疏水側(cè)鏈基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散

6、。理化性質(zhì)改變，溶解度降低，沉淀，粘度增加。理化性質(zhì)改變，溶解度降低，沉淀，粘度增加。生物化學(xué)性質(zhì)改變，易被蛋白酶水解。生物化學(xué)性質(zhì)改變，易被蛋白酶水解。b.b.引起蛋白質(zhì)變性的主要因素：引起蛋白質(zhì)變性的主要因素：n溫度（熱、溫度（熱、冷冷）n強(qiáng)酸、強(qiáng)堿強(qiáng)酸、強(qiáng)堿n尿素和鹽酸胍的影響尿素和鹽酸胍的影響（破壞分子內(nèi)部氫鍵、破壞疏水效應(yīng)）（破壞分子內(nèi)部氫鍵、破壞疏水效應(yīng)）n H H2 2N-C-NHN-C-NH2 2 H2N-C-NHH2N-C-NH2 2+ +ClCl- -n表面活性劑的影響：如十二烷基硫酸鈉（表面活性劑的影響：如十二烷基硫酸鈉（SDSSDS） CH CH3 3- -（CHCH2

7、 2）1010-CH-CH2 2-O-S-O-O-S-O-.-.NaNa+ + （1.4gSDS/1g1.4gSDS/1g蛋白）蛋白）O ONHNH2 2ooc.c.蛋白質(zhì)的復(fù)性蛋白質(zhì)的復(fù)性n當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)到天當(dāng)變性因素除去后，變性蛋白質(zhì)又可恢復(fù)到天然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性然構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。）。nTrpTrp、TyrTyr和和PhePhe在在280280nm nm 附近有最大吸收。附近有最大吸收。因此，利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)因此，利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定和定量測定。行定性鑒定和定量測定。二、分離純化蛋

8、白質(zhì)的主要方法二、分離純化蛋白質(zhì)的主要方法 （一）根據(jù)溶解度差異分離：選擇性沉淀（一）根據(jù)溶解度差異分離：選擇性沉淀法法 等電點(diǎn)沉淀法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法（二）、根據(jù)（二）、根據(jù) 分子大小和形狀的差異分子大小和形狀的差異分離分離透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)透析和超濾法：除去小分子物質(zhì)半透膜阻留半透膜阻留pr分子，分子，而讓小的溶質(zhì)分子和而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達(dá)到除去水通過，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。（鹽、低分子酸等）。施以一定的壓力使小施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過一半透分子溶質(zhì)通過一半透膜，而按半透膜的篩膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋孔大小

9、截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子白質(zhì)分子沉降的速度與顆粒的大小沉降的速度與顆粒的大小和密度有關(guān)。和密度有關(guān)。離心后按其離心后按其沉降的速度不同，彼此分沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)開形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采定位，針刺或冰凍切片采樣分析樣分析密度梯度離心法密度梯度離心法 凝膠過濾層析的原理凝膠過濾層析的原理:介質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖（介質(zhì)：交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-Gel P ，），） 瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-Gel A）凝膠過濾法凝膠過濾法（三）（三） 根據(jù)電荷性質(zhì)的差異分離根據(jù)電荷性質(zhì)的差異分離 1、電

10、泳和等電聚焦法：電泳和等電聚焦法：普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳裝置裝置：圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直：圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。板電泳。支持物支持物： PAGE 、瓊脂糖膠等）瓊脂糖膠等）Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)Molecules are separated by size and charge in an electric field.Isoelectric Focusing relies on the migration of charged proteins in an electric field等電聚焦法等電聚焦法 2、離子交換層析法、離子交換層析法 基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)葡聚糖、樹脂基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)葡聚糖、樹脂電荷基團(tuán)：電荷基團(tuán)： （四）（四） 配體親和力的差異配體親和力的差異 ： 親和層析親和層析 親和層析親和層析:利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力。識別能力。配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體，生物素與親和素（抗親和素蛋白），凝集素。（五）（五）HPLC（high