Egr1特異誘騙寡核苷酸下調(diào)CCN1抑制大鼠血管平滑肌細胞遷移

1、.優(yōu)秀畢業(yè)論文中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Egr-1特異誘騙寡核苷酸下調(diào)CCN1抑制大鼠血管平滑肌細胞遷 移姓名：徐否申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：劉閨男201103：精品參考文獻資料·中文論著摘要·Egr-1特異誘騙寡核苷酸下調(diào)CCNI抑制大鼠血管平 滑肌細胞遷移目的通過對原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞中轉(zhuǎn)染針對早期生長反應(yīng)因子1(early growth l'csponsc factor-1，Egr-1)的誘騙寡核苷酸(decoyoligodeoxynucleotide，decoy ODN)，檢測轉(zhuǎn)染前后血管平滑肌細胞(vascular smooth mus

2、cle cell，VSMC)中Egr-1和富含半胱氨酸蛋白6l(刪n硎ch 61，CCNlCYR61)的表達變化并測量VSMC遷移情況，探討針對Egr-1的decoy ODN對體外培養(yǎng)的大鼠平滑肌細胞遷移的影響和作用機制。方法取大鼠胸主動脈中膜，通過組織塊貼壁法進行原代大鼠動脈VSMC培養(yǎng)，傳 代培養(yǎng)和鑒定，設(shè)計合成針對Egr-1的decoy ODN及誘騙對照寡核苷酸。細胞爬 片后應(yīng)用人工合成的Egr-I decoy ODN進行細胞轉(zhuǎn)染。將實驗分為對照組(正常 培養(yǎng)細胞)、誘騙組(Egr=l decoy ODN轉(zhuǎn)染組)、誘騙對照組(雜碼寡脫氧核苷酸 轉(zhuǎn)染組，Egr-1 decoy ODN SC

3、R)。采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后各組不同時間點 (24h、48h、72h)Egr-1及CCNlmRNA的表達情況，免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染前 后各組不同時間點(24h、48h、72h)的Egr-1及CCNl蛋白的表達變化，進行圖像 分析，并采用劃痕法測定VSMC的遷移距離。所有數(shù)據(jù)均采用SPSSl60統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(孑士s)表示，各組間比較應(yīng)用單因素方 差分析，P<005有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果成功進行原代VSMC培養(yǎng)，經(jīng)細胞鑒定培養(yǎng)細胞為高純度的VSMC。轉(zhuǎn)染Egr-1decoy ODN及Egr-1 decoy ODN SCR，觀察各組不同時f司點Egr-1和

4、CCNl mRNA及蛋白表達情況。RT-PCR結(jié)果顯示：Egr-1和CCNl mRNA在對照組，誘騙組及誘騙 對照組中均有表達。在不同時間點，誘騙組E鏟1和CCNl n1盼隊的表達均低于對 照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P<005，有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示：Egr-I和 CCNl蛋白在三組中均有表達。在不同時間點，誘騙組Egr-I和CCNl蛋白的表達均 低于對照組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P<005，有統(tǒng)計學(xué)意義。劃痕實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后 48h，對照組、誘騙組及誘騙對照組VSMC遷移距離分別為10523士781、5865士1268、10647士760pma，誘騙組VSMC的遷移距離明顯低于其

5、它兩組 口<001)。結(jié)論Egt-1是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可以促進VSMC的增殖、遷移。對體外培 養(yǎng)的VSMC轉(zhuǎn)染Egr-I decoy ODN可在一定程度上抑制Egr-1和CCNl mRHA及 蛋白表達，從而抑制VSMC遷移，為再狹窄等血管增殖性疾病的治療提供了新的 靶點。關(guān)鍵詞Egr-l；CCNI；誘騙；VSMC；細胞遷移；再狹窄2·英文論著摘要·Decoy Oligodecoxynucleotides Targeting Egr-1 Downregulating C CNI to Inhibit Rat Vascular Smooth Muscle Cells

6、 MigrationObjectiveBy detecting proliferation of the rat's aortic smooth muscle cells which 8retransfected early growth response factor-1(Egr-1)decoy oligonucleotide,(ODNs)toprimary cultured vascular smooth muscle cells(VSMCs)and the expression changes ofEgr-I and CCNl WSS checked,the spread of

7、migration of VSMCs WaS observed for approach to the effect and mechanism of the Egr-1 decoy ODNs Oil the migration of VSMCs ofrats in vitroMethodsAfter the primary culture and passage culture of original arterial smooth muscle cells(SMCs)fIom rats with tissue explants adherent method,passing the ide

8、ntification,Egr-I decoy oligonucleotides(Egr-1 decoy ODN)and Egr-1 transfection decoy ODN miscellaneotm yards(Egr-1 decoy ODN SCR)were designed andsynthesied to lure control oligonucleotides，吐len the artificial synthetic Egr-1 decoyODNs were transfected on VSMCsThe cultured VSMCs were packeted into

9、normal control group(normal cultured cells)，decoy group(transfected Egr-1 decoy ODNs)，1ed to the control group(transfected Egr-1 decoy ODN SCR)Then we detected the mRNA level and the protein expression of Egr-1 and CCNI using RT-PCR and immunohistochemical method at the different time points，for exa

10、mple，24h,48h,72h,and taked the imageanalysisThe migration lenth of each group was observed by wound-healing assayAll data were used SPSS I 60 statistical software for statistical analysis,measurement data to the averagea：standard deviation(i+s)said that the comparison between groups used3single-fact

11、or variance analysis，P<005 represents statistical significanceResuitsIt is successful to make primary vascular smooth muscle cells cultured,豳ce the cultured cells ale identified to be homopured VSMCARer the transfecting ofthe Egr-1 decoy ODNs and Egr-1 decoy ODN SCR on VSMCs,we detected the mRNA

12、level and the protein expression of Egr-1 and CCNl at the different time points of each groupThe results of RT-PCR showed that there is certain expression of Egr-l and CCNI mRNA in these three groupsAt the different time points，the level of Egr-I and CCNl mRNA were decreased obviously in the decoy g

13、roup compared with the other groups，which proved to be statistical significant(P<005)Cell immunohistochemistryanalysis showed that there is certain expression of Egr-1 and CCNl protein in thesethree groupsAt the different time points,the level of Egr-I and CCNl protein WerO 山幻嗽峪ed obviously in th

14、e decoy group compared with the other groups，which proved t0 be statistical significant(P<005)Wound-healing assay showed that the migrationlenth of the group control，decoy and decoy SCR was105234-781，5865-a=1268，10647士760ttm respectivelyThe migration lenth of the decoy group is much shorter than

15、the other groups(P<Ooi)There was no significant di伍即胱betwm the group control and decoy SCRConclusionsThis experiment o刪叫inn that Egr-1 is an important nuclear transcribe factor,which c蛆promote the proliferation and the migration of the VSMCsTraasfecting the decoy ODN of Egr-1 to the arterial VSMC

16、s of rat in vitro c41n decrease the expression of Egr-I and CCNl，to achieve the purpose ofinhibiting cdl proliferation and migrationKey wordsEgr-1；CCN 1；do'。oy,smooth muscle cells；cell migration；restenosis4·英文縮略語·5縮略語S-PTF VSMC英文全稱str，叩飽叫din-perosidase位副部cription factors vascular stn，t

17、h muscle cell6中文全稱那根過氧化物酶標(biāo)記 的鏈酶卵白素 轉(zhuǎn)錄因子 血管平滑肌細胞·論文·Egr-1特異誘騙寡核苷酸下調(diào)CCNl抑制大鼠血管平滑肌細胞遷移刖吾 目前認(rèn)為經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入術(shù)(petcutancous coronary intervention，PCI)是治療冠狀動脈狹窄的有效方法，但術(shù)后血管再狹窄(restenosis，RS)影響了其遠期療效。再狹窄是動脈損傷后的愈合反應(yīng)，是一系列血管活性物質(zhì)和生長因子 介導(dǎo)的復(fù)雜的生物過程。此過程包括血栓形成、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)膜增生、細胞 外基質(zhì)大量形成、血管重塑等反應(yīng)。其中血管內(nèi)膜增生和血管重塑是再狹窄發(fā)生

18、 的重要病理機制，而血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)移行、 增生和分泌是血管內(nèi)膜增生的三個重要環(huán)節(jié)。因此尋找有效的方法抑制VSMC遷 移和增殖是防止再狹窄的主要措施之一。研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TF)可以調(diào)節(jié)多個VSMC增 殖，遷移相關(guān)基因的表達，從不同層面調(diào)控VSMC的增殖與遷移【蚴。早期生長反應(yīng)因子·l(early growth response factor-I，Egr-1)作為主要的血管中病理性TF， 在血管再狹窄的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。Egr-1屬即刻早期基因(immedi

19、ate early gene，lEG)家族成員之一，是一種鋅指結(jié)構(gòu)盯，血管機械損傷后Egr-1快 速上調(diào)其表達，調(diào)控著多種與細胞增殖，遷移相關(guān)基因的表達，從而誘導(dǎo)VSMC 的增殖和遷移，在血管再狹窄過程中起著重要作用【341。富含半胱氨酸蛋白6l(cysteine-rich 61，CYR61CCNl)是一種IEG，在多種 組織的成纖維細胞，血管內(nèi)皮及平滑肌細胞等都可表達。它具有多種生物學(xué)效應(yīng) 包括促進細胞趨化，粘附，增殖，新血管生成和細胞外基質(zhì)(extraccllular matrix， ECM)合成等作用。研究表明，CCNl的表達與損傷血管處內(nèi)膜增生程度密切相關(guān)51，在血管損傷增生再狹窄過程

20、中可發(fā)現(xiàn)CCNl的高表達，并通過整合素a681誘7導(dǎo)平滑肌細胞的趨化和遷移。誘騙性寡核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide，decoy ODN)技術(shù)是將人工合 成的雙鏈寡核苷酸作為誘餌順式元件引入到靶細胞中競爭性地與活化TF的特異 序列識別結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)合，抑制TF與其調(diào)控的能促進VSMC增殖、遷移的下游基因的啟動子調(diào)控序列特異性結(jié)合，抑制下游基因表達，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制VSMC的增殖、遷移。本實驗擬通過觀察Egr-1 decoy ODN體外轉(zhuǎn)染VSMC后，對Egr-I和CCNl mRNA及蛋白表達以及VSMC遷移距離的影響，進一步探討Egr-1dec0Y ODN的 作用機制，為

21、防治血管再狹窄提供一種新的基因治療思路。實驗材料與方法一、實驗材料 (一)實驗動物：健康雄性Wistar大白鼠，體重120-1509，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，由中國醫(yī)科大學(xué)實 驗動物中心提供。(二)實驗試劑：Egr-I decoy ODN、Egr-1 decoy ODN SCR(大連寶生物工程有限公司) 胎牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司) DMEM干粉(Gibe,o)胰蛋白酶(Oibco) FuGENE6(Roche) 青霉素、鏈霉素(華北制藥廠)a-SMactin小鼠抗大鼠單克隆抗體(Sigma)RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司) PCR引物合成(大連寶生物工程有限公司) D

22、NA分子量MarkerDLl000(大連寶生物工程有限公司)Trizol(Invitrogcn)Egr-1兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)CCNl兔抗大鼠多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司) Sp試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司) DAB染色劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司) 瓊脂糖(上海生物工程有限公司)(三)實驗儀器： C02培養(yǎng)箱(Hemeus) 無菌超凈臺(蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司) 倒置顯微鏡(Olympus) 熒光顯微鏡(Olympus)普通離心機TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器廠) 數(shù)顯電熱水浴箱HHW6002型(上海躍進醫(yī)療器械廠) PCR儀Uno II型(Bi

23、omctra)紫外分光光度計UV-3000(日本島津公司) 多功能電泳儀MultiphorII型(Pharmacia)凝膠自動成像及分析系統(tǒng)Chemi Imaga"5500(Alpha Innotcch)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(MetaMorph Imaging system)垂直電泳槽Mini-PROTEAN II(BIO-RAD)6孔、24孔培養(yǎng)板(Coming) 微量移液器(Gilson France)直徑35mm塑料培養(yǎng)皿(Coming) 50ml玻璃培養(yǎng)瓶(江陰光明玻璃儀器廠) 眼睛剪、眼睛鑷、刀片、止血鉗、剪刀、手術(shù)縫針及鋒線、注射器、吸管二、試驗方法(一)大鼠VSMC的原代培

24、養(yǎng)及傳代培養(yǎng) l、VSMC的原代培養(yǎng)： 采用組織貼壁法進行大鼠VSMC的原代培養(yǎng)，取Wistar大鼠，用10水合氯醛腹腔注射麻醉(35mgkg)后，用75酒精消毒。在無菌條件下取出胸主動 脈，立即用含有青霉素(100Um1)和鏈霉素(100Um1)的無菌磷酸鹽緩沖液9(phosphate buffered solution，PBS)沖洗23次，直至血凝塊完全沖洗干凈。用 眼科鑷輕輕剝離血管外的結(jié)締組織和外膜，PBS沖洗干凈后縱向切開血管，內(nèi)膜 面向上平鋪于無菌玻璃培養(yǎng)皿中。用彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜面2次，蘸少許025胰 蛋白酶涂抹內(nèi)膜約lmin，用20FCS+DMEM培養(yǎng)液終止消化，并保持組織濕 潤

25、，用鋒利的刀片將其切成lmmz大小的組織塊，然后內(nèi)膜向下直接均勻擺放于35ram塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，間距為5mm。于37，5C02飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)靜 置1-2h，待組織塊貼壁牢固尚未完全干涸時，緩慢加入少許培養(yǎng)液(1-2m1)浸潤 組織塊。繼續(xù)放入孵箱內(nèi)靜置培養(yǎng)5-7天，盡量減少振蕩和移動。待有細胞從組 織塊邊緣爬出以后再半量換液。2、VSMC的傳代培養(yǎng)：待細胞長滿皿底接近80融合時，進行細胞傳代。倒掉舊培養(yǎng)液，用PBS沖 洗2次后，加入適量025胰酶室溫消化。然后放于倒置顯微鏡下觀察，待大部 分細胞胞質(zhì)回縮變圓時，加入含有血清的DMED培養(yǎng)液終止消化。接著吹打細胞 懸液，移入離心管，離去上清，

26、加入含20的FCS+DMEM重懸，1：2接種于新 的培養(yǎng)瓶內(nèi)，補充培養(yǎng)液(約3-4ml瓶)，放入37，5cch飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)。培養(yǎng)3代以后換用10FCS+DMEM培養(yǎng)液。本實驗取38代進行實驗。(二)細胞鑒定l、形態(tài)學(xué)觀察： 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)為貼壁生長的梭形細胞。 2、平滑肌細胞a-SMactin的免疫組織化學(xué)鑒定：(1)細胞爬片：將傳代獲得的細胞接種預(yù)先處理(泡酸，高壓)的蓋玻片上， 待細胞完全伸展，形態(tài)飽滿長至70-80后，取出細胞爬片，PBS沖洗2次，75酒精溶液4固定30min，4"C晾干。(2)用小鼠抗大鼠a-SMactin單克隆抗體，采用S-P法對細胞爬片

27、進行免疫 組織化學(xué)染色：用樹膠固定蓋玻片，PBS沖洗5minx3次，用濾紙吸去PBS液。滴 加02TritonX-100覆蓋細胞表面，37孵育30min。PBS沖洗5minx3次，吸干。 滴加一滴B液(非免疫動物血清)，放入溫箱內(nèi)37"C孵育30min，然后甩去B液， 滴加1：100稀釋的a-SMactin小鼠抗大鼠IgG抗體，放置保濕盒內(nèi)4"C冰箱過夜。10第二天取出后室溫放置10min，PBS沖洗5minx3次。滴加一滴C液(生物素標(biāo)記 的第二抗體)，溫箱內(nèi)37"(3孵育30min，PBS沖洗5minx3次。滴加D液(鏈霉素抗 生物素一過氧化物酶溶液)，37&

28、quot;(3孵育30min。PBS沖洗5minx3次。配制DAB液 顯色劑：A、B、C液各一滴按順序加入蒸餾水至lml，混勻避光保存。滴加新鮮 配制的DABl009l，顯微鏡下觀察顯色5min。見到明顯陽性顯色(以細胞內(nèi)呈棕黃色為陽性)后終止顯色，自來水沖洗2-3min。 (3)細胞核復(fù)染：蘇木素復(fù)染10min左右，自來水沖洗，l鹽酸酒精分化3s，自來水沖洗、返藍。梯度酒精脫水：75、85酒精各ls，95酒精10s，100 酒精I、II各5min，二甲笨I、透明各3min，細胞面向下用中性樹膠封固，最 后放置室溫陰涼處風(fēng)干24h。于顯微鏡下觀察記錄拍照。(三)設(shè)計合成Egr-1 decoy

29、ODN和Egr-1 decoy ODN SCRl、根據(jù)geneBank中Egr-I啟動子區(qū)域基因序列，委托大連寶生 物公司合成針對大鼠Egr-1的雙連誘騙寡脫氧核苷酸(decoy ODN)， 其基因序列為：上游5-TCG CCC TCG CCC CCG CTAAGC論-3 下游3'-AGC oGG GGC GGG GIGC GAT TCCC一52、同時合成Egr-1的雜碼誘騙寡脫氧核苷酸(decoy ODN SCR)即包含有無關(guān)亂序的雙鏈寡脫氧核苷酸，其基因序列為：同誘騙序列類似的亂序排列雙鏈寡核苷酸 上游5'-AGC CGC ACC GC,C CTG CCT CGTC3 下游

30、3-TCG GCG TGG CCG GAC GGA GCAG-5經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法純化并凍干保存，3端和5端進行硫代修飾，部分 誘騙寡核苷酸5端用異硫氰酸熒光素(fluorcsc,cin isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記用 于觀察轉(zhuǎn)染效率。(四)實驗分組將培養(yǎng)的平滑肌細胞分為三組：對照組(正常培養(yǎng)細胞)、誘騙組(轉(zhuǎn)染Egr-1decoy ODN)、誘騙對照組(轉(zhuǎn)染Egr-1 decoy ODN SCR)。實驗時各組細胞均使用含10FCS的不含抗生素DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘騙組轉(zhuǎn)染O19molL decoy ODN，誘騙對照組轉(zhuǎn)染OI pmolL decoy ODN SCR。(五)

31、Egr-1 decoy ODNs轉(zhuǎn)染及效率觀察于24孔培養(yǎng)板中接種細胞，在lOFCS的DEME中，于37，5C02飽 和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞80融合后更換DMEM培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在 15ml無菌Eppcndorf管中先加入無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基，再加入適量的FuGENE6脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑作為載體孵育，以提高轉(zhuǎn)染效率，按FuGENE6與ODN 之比為3：1(體積與質(zhì)量之比)的比例加入Egr-1 dewasy ODN或Egr-I dex：oy ODN SCR并混勻孵育15min。以O(shè)1lanoLL將轉(zhuǎn)染復(fù)合物注入孔內(nèi)，進行基因轉(zhuǎn)染， 18h后更換含10FCS無抗生素的DMEM進行二次轉(zhuǎn)

32、染，繼續(xù)培養(yǎng)細胞13天用于以后相關(guān)檢測。FITC標(biāo)記的ODN轉(zhuǎn)染后，避光培養(yǎng)24h，在倒置熒光顯微鏡 下觀察轉(zhuǎn)染效率。(六)RT-PCR檢測Egr-I和CCNl mRNA的表達 l、采用Trizol試劑一步法對大鼠VSMC總RNA的提取 50ml玻璃培養(yǎng)瓶中的待測VSMCs生長至70匯合時，棄去培養(yǎng)液，加lmlTrizol試劑于培養(yǎng)瓶中，用槍頭反復(fù)吹打貼壁的細胞，保證細胞全部裂解，吸出置 于15l的Eppendorff管。室溫放置10min，加入200p1氯仿，用力振蕩15s，于室 溫靜置2min，llOOOrpm，4離心15min。收集上層無色水相500弘1于另一個1Sml 的Eppendo

33、rff管內(nèi)，加入500m的異丙醇，震蕩混勻，室溫下靜置10min，llOOOrpm，4離心15rain。棄去上清，沉淀物加入lml的75酒精洗滌，酒精由二乙基焦碳 酸鹽(dlcthypyrocarbonate，DEPC)處理水配制，llOOOrpm，4"C離心15rain。棄去 上清，將Eppendorff管于室溫下干燥沉淀。加入10m經(jīng)lErasol處理的雙蒸水液， 充分振蕩，70冰箱保存?zhèn)溆谩?、總RNA量和純度的檢測及濃度的調(diào)整將提取的RNA溶液lm用經(jīng)1oErasol處理的雙蒸水液稀釋至80pl，用紫外 分光光度計測定260hm和280nto的吸光度，分別用OD260和OD2

34、80表示，并計 算OD260OD280值，當(dāng)OD260OD280在1820時認(rèn)為其濃度和純度合格。 RNA濃度(PgI_t1)=OD260x稀釋倍數(shù)x401000。根據(jù)樣品的OD260值將RNA用12經(jīng)1oErasol處理的雙蒸水液稀釋至lingm，-2012冰箱保存?zhèn)溆谩?、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按RT-PCR試劑盒說明，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為eDNA。10lm反 應(yīng)體系如下：MgCl2 2m，10xRT buffer 1m，dNTP Mixture(各10raM)lid，Rnase Inhibitor o25p1，AMV Reverse Traascdptase 051d，Raadom 9

35、mers 059l，樣品RNA lm，RNaseFreedH203751上1。02ml薄壁PCR反應(yīng)管中加入模板RNA及隨機引 物后，先瞬時離心混勻，置PCR儀中3010min，4230min，99變性5min滅 活逆轉(zhuǎn)錄酶，55min終止反應(yīng)。4、PCR擴增反應(yīng)參考文獻設(shè)計特異性引物見表1。以反轉(zhuǎn)錄所得eDNA為模板進行PCR擴增 反應(yīng)。50皿反應(yīng)體系如下：5xPCR buffer 10m，雙蒸水28751d，Taq DNA polymeraseOUp1)o25m，上下游特異性PCR引物各0Sgl，eDNA 109l。各指標(biāo)的反應(yīng)條件分別為：7Egr-1：93預(yù)變性5min，93變性30s，

36、60退火30s，7212延伸60s，共 30個循環(huán)，最后72延伸10rain：CCNl：94預(yù)變性3min，94變性30s，60退火30s，72延伸60s，共 30個循環(huán)，最后72延伸10miraGAPDH：94預(yù)變性5min，94變性30s，5512退火30s，72延伸60s，共 35個循環(huán)，最后72延伸10min。表l，引物序列和擴增片段長度5、電泳及成像13擴增結(jié)束后取5pIPCR產(chǎn)物與4Ill上樣緩沖液混合，進行15瓊脂糖凝膠電 泳(120V,45min)，溴化乙啶染色，凝膠自動成像分析系統(tǒng)掃描成像。采用全自動圖 像分析系統(tǒng)進行電泳條帶的平均光密度和發(fā)光面積的測定。PCR產(chǎn)物的含量用電

37、 泳條帶的積分光密度的數(shù)值表示(積分光密度=平均光密度X發(fā)光面積)。以GAPDH 表達為內(nèi)參，以每份標(biāo)本的擴增條帶與內(nèi)參照擴增條帶的積分光密度值(IoD) 比值作為待測基因mRNA的相對表達量。(七)細胞免疫組織化學(xué)法檢測Egr-1和CCNl蛋白表達 l、檢測轉(zhuǎn)染前后Egr-I蛋白表達變化采用S-P法進行細胞爬片免疫組織化學(xué)染色，Egr-1抗體濃度1：100。步驟如 下：將細胞爬片用75酒精固定，待用。用樹膠固定蓋玻片，PBS沖洗5minx3 次，用濾紙吸去PBS液，滴加02 Triton-X-100覆蓋蓋玻片，37孵育30min。 PBS沖洗5minx3次，吸干。滴加A液(內(nèi)源性過氧化物酶阻

38、斷劑)，室溫放置15min。 PBS沖洗5minx3次。加入B液(非免疫動物血清)，放入溫箱內(nèi)37"(2孵育30min。 然后甩去B液，加入用PBSl：100稀釋的Egr-1兔抗大鼠多克隆抗體，放置保濕 盒內(nèi)4過夜。4過夜后37復(fù)溫45rain，PBS沖洗5minx3次，吸干。滴加C 液(生物素標(biāo)記的第二抗體)，溫箱內(nèi)37"C孵育30min，PBS沖洗5minx3次。滴加 D液(鏈霉素抗生物蛋白過氧化酶>，溫箱內(nèi)37孵育30min，PBS沖洗5minx3 次。配制DAB液顯色劑：A、B、C液各一滴按順序加入蒸餾水至lml，混勻避 光保存。滴加新鮮配制的DAB顯色劑各l

39、滴加入每個載玻片上，顯微鏡下觀察 310mia，見到明顯陽性顯色(以細胞內(nèi)呈棕黃色為陽性)后終止顯色，自來水沖洗2-3rain。接著用過濾好的蘇木素染色10min左右，自來水沖洗。然后用I鹽酸酒 精分化數(shù)s，自來水沖洗、返藍。梯度酒精脫水：75、85酒精各Is，95酒 精10s，100酒精I、各5min，二甲笨I、II透明各3min，蓋玻片細胞面向 下用中性樹膠封固，最后放置室溫陰涼處風(fēng)干24h。本實驗采用MetaMorph圖像 分析系統(tǒng)分析(各組分別取3張片子，每張片子選取5個不同視野)，計算積分光密 度值大小。2、檢測轉(zhuǎn)染前后CCNl蛋白表達變化采用S-P法進行細胞爬片免疫組織化學(xué)染色，C

40、CNl抗體濃度I：100，檢14測及分析方法同前。(八)劃痕法觀察VSMC遷移能力，計算遷移率將正常培養(yǎng)的VSMC進行細胞爬片，待細胞長至約70時，分組進行第一次 轉(zhuǎn)染(019molL ODN)，轉(zhuǎn)染結(jié)束前2h加入絲裂霉C(20“molL，Sigma)孵育，1001tl 無菌槍頭沿細胞爬片的對角線劃痕后，換含10FCS無抗生素DMEM進行第二 次轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48h后，75酒精40C固定30min，蘇木素伊紅(HE)染色，中性樹 膠封片。光鏡下觀察每組任意5個爬片的劃痕寬度變化，用ImagePro PlusAnalysis軟件測量VSMC遷移距離，取平均值。 細胞遷移能力以遷移距離表示：遷移距離=

41、原劃痕寬度一現(xiàn)劃痕寬度(九)統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSSl60統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (i士s)表示，各組間比較應(yīng)用單因素方差分析，當(dāng)P<O05時，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意 義。實驗結(jié)果一、原代培養(yǎng)的VSMC鑒定(一)形態(tài)學(xué)觀察原代培養(yǎng)56天后，倒置顯微鏡下觀察可見細胞從組織中遷移游出，呈長梭形， 細胞核呈圓形或卵圓形，位于細胞中央，有一個或多個核仁，胞質(zhì)豐富。細胞生 長致密時平行排列成束，部分重疊，呈典型“峰谷”樣生長。圖l，正常培養(yǎng)的平滑肌細胞形態(tài)(100x)(二)免疫組織化學(xué)法鑒定VSMC特異性標(biāo)志蛋白a-SMactin免疫組織化學(xué)染色可見：大部分細胞的細胞質(zhì)中有

42、大量棕黃色絲狀物存在(肌絲)，沿細胞縱軸平行排列，細胞核呈圓形，用 蘇木素復(fù)染呈淡藍色。證明所培養(yǎng)的細胞為高純度的VSMC。圖2，VSMC的僅SMactin免疫組織化學(xué)鑒定(200x)二、轉(zhuǎn)染效率觀察經(jīng)ODN轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下可見大部分轉(zhuǎn)染細胞顯示FITC的黃綠色熒光， 大部分位于細胞核內(nèi)，少數(shù)位于胞漿，轉(zhuǎn)染效率可達6070。三、Egr-1 decoy ODN可下調(diào)Egr-1和CCNl mRNA表達水平RT-PCR法分析轉(zhuǎn)染后不同時間點(24h、48h、72h)Egr-1和CCNl mRNA表達 變化，結(jié)果顯示：對照組、誘騙組及誘騙對照組中Egr-1和CCNl mRNA均有表達f見 表2，圖

43、3)，24h時表達最明顯，隨著時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。在三個不同時間 點，誘騙組Egr-1和CCNl mRNA的表達均低于對照組及誘騙對照組，24h時CCNlmRNA表達減少最明顯(見圖4、圖5)，48h、72h表達持續(xù)減少，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析 P<005，有統(tǒng)計學(xué)意義。表2，RT-PCR法檢測各組不同時間點的Egr-1和CCNl mRNA積分光密度比 值(Ir=3，i士s)注：棗表示與對照組及誘騙對照組相比P<00516尸卜24h卜48h廠卜72h瑚I：妥注：M：Maker；l：對照組：2：誘騙組；3：誘騙對照組圖3，Egr-1 decoy ODN對VSMC中Egr-1和CCNl mR

44、NA表達的影響3500030000j粵25000口對照組囂20000誘騙組米15000隸口誘騙對照聚10000050000000024h48h72h時間(h)圖4，Egr-1 decoy ODN對培養(yǎng)VSMC中Egr-1 mRNA(積分光密度值)表達 的影響注：幸表示與對照組及誘騙對照組相比P<00535003000j四2500囂2000對照組誘騙組米-1500口誘騙對照組、鼷10000500000024h48h72h時間(h)17圖5，Egr-1 decoy ODN對培養(yǎng)VSMC中CCNl mRNA(積分光密度值)表達的影響注：棗表示與對照組及誘騙對照組相比P<005四、Egr-

45、1 decoy ODN可下調(diào)Egr-1與CCNl蛋白表達水平免疫組織化學(xué)染色S-P法分析轉(zhuǎn)染后不同時間點(24h、48h、72h)Egr-1和CCNl 蛋白表達變化，結(jié)果顯示：對照組，誘騙組及誘騙對照組dPEgr-1和CCNl蛋白均 有表達，24h時表達最明顯，隨著時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢(見表3)。在三個不同時 間點，誘騙組Egr-1和CCNl蛋白的表達均低于對照組及誘騙對照組，24h時Egr-1 和CCNl蛋白表達減少最明顯(見圖6、圖7、圖8)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P<005，有統(tǒng)計 學(xué)意義。表3，免疫組織化學(xué)法檢測各組不同時間點的Egr-1和CCNl蛋白積分光密度 比值(n=3，i土s)注

46、：幸表示與對照組及誘騙對照組相比P<005受蠢>硬二卜一j最j、。窿鍪囂：，r慕公鬻、。·是等曩薯、，L l，f|=對照組誘騙組誘騙對照組 圖6，Egr-1 decoy ODN轉(zhuǎn)染培養(yǎng)VSMC 48h后CCNl蛋白表達變化(SP法，100x)蛩20豳對照組塑15誘騙組階冒 一一。一蔚糊疆 。一一莨窿燧。一一攀蕾意蠢一。鋒巨巨套10口對照誘騙白00，咔Lf卜0r點24h48h72h時間(h)圖7，Egr-1 decoy ODN對培養(yǎng)VSMC中Egr-1蛋白(積分光密度值)表達的 影響注：·表示與對照組及誘騙對照組相比P<005252015對照組誘騙組10口對

47、照誘騙組圖8，Egr-1 decoy ODN對培養(yǎng)VSMC中CCNl蛋白(積分光密度值)表達的影響注：表示與對照組及誘騙對照組相比P<005五、Egr-1 decoy ODN抑制VSMC遷移劃痕實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，Egr-1 decoyODN轉(zhuǎn)染后48h誘騙組VSMC 的水平遷移距離明顯減少(見表4，圖9、圖10)，而誘騙對照組變化不大。提示 Egr-1 decoy ODN能夠明顯抑制VSMC的水平遷移(P<o01)，而Egr-1 decoy ODN SCR對VSMC遷移無影響。表4，Egr-1 decoy ODN轉(zhuǎn)染48h后VSMC遷移距離(j士s，n=5)19誘騙組58

48、65士1 268毒誘騙對照組1 06·47士7·60120，-、E 100j80一對照組超 60誘騙組蓉 40口誘騙對照組漤20劃0圖9，Egr-1 decoy ODN轉(zhuǎn)染48h對VSMC遷移距離的影響 注：幸表示與對照組及誘騙對照組相比P<001。磊褥_惑·磊嬲專島愛孿'氣I'一、一：j-惑，X、，；慕曩，t名、噙一+·，-·、 -1，一。：t、f，0；一釜一·懈，!；j瀝i：0'劃痕起始時對照組， I 1一，蟛， -· 墨、 -誘騙組誘騙對照組圖10，Egr-I decoy ODN轉(zhuǎn)染48h

49、后VSMC遷移變化(HE染色，100x)討論PCI是治療冠心病的重要方法之一，現(xiàn)已得到了廣泛應(yīng)用。但PCI術(shù)后再狹 窄的發(fā)生嚴(yán)重影響了其遠期療效。因此，PCI術(shù)后再狹窄的防治一直以來都是研 究的熱點。目前認(rèn)為，血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖及增殖后的平滑肌細胞 由血管中層向內(nèi)膜的遷移是引起PCI術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵因素之一【6，J丌。正常動脈血管由內(nèi)、中、外膜三層組成。內(nèi)膜主要包括內(nèi)皮，內(nèi)皮下層和內(nèi) 彈性膜；中膜主要是平滑肌細胞，其中夾有彈性纖維和膠原纖維；外膜主要是結(jié) 締組織、彈性纖維以及支配血管神經(jīng)纖維和營養(yǎng)血管組成。冠狀動脈屬于含有豐 富平滑肌的肌性動脈。通常，血管中層平滑肌細胞處于靜息狀

50、態(tài)，不會向內(nèi)膜遷 移。然而PCI術(shù)會引起血管內(nèi)皮細胞損傷，脫落，使內(nèi)皮下組織甚至中膜暴露于 血液，致使血中大量血小板黏附，聚集于損傷部位。血小板被激活后釋放一些活 性物質(zhì)，導(dǎo)致VSMC增生，使中膜平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移，并再次增生s,gl。在此 過程中VSMC從收縮型轉(zhuǎn)變成以分泌為主的合成型，分泌并沉積大量細胞外基質(zhì) (ECM)，包括膠原，彈性纖維及氨基葡聚糖沉積于動脈壁上，造成內(nèi)膜增生性病 變引起血管再狹窄【10'1¨。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和研究的不斷深入，對再狹窄分子機制的研究已深入 到基因水平。研究表明：某些轉(zhuǎn)錄因子(11F)可以調(diào)節(jié)多個VSMC增殖，遷移相 關(guān)基因的表達

51、，從不同層面調(diào)控VSMC的遷移與增殖【l,21。TF是一種與基因啟動 子中特定序列結(jié)合，行使調(diào)控基因表達功能的DNA結(jié)合蛋白。Egr-1屬即刻早期基因(IGE)家族成員之一，是一種鋅指結(jié)構(gòu)TF，多種信號刺激可迅速誘導(dǎo)其表 達，其功能主要表現(xiàn)在細胞內(nèi)信號傳遞方面及參與多種基因調(diào)控。Egr-1在調(diào)控諸多靶基因的表達過程中能夠單獨或與其他核蛋白結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體而發(fā)揮作用，對細胞生長、發(fā)育、分化和損傷修復(fù)起著重要作劇眩】。當(dāng)細胞受到某些刺激，如： 應(yīng)激、缺血缺氧、細胞內(nèi)毒素、細胞因子、離子輻射、腫瘤等刺激可引起膜的去 極化，使本來處于休眠狀態(tài)的Egr-I很快被激活，使細胞由G舊期進入Gl期，導(dǎo) 致細胞增

52、殖。Egr-1在正常血管壁低水平表達或不表達，但動脈損傷或其他刺激可 誘導(dǎo)其表達上調(diào)，并促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的分裂、2l增殖和遷移【3,41。細胞及動物實驗證呼13，14】：通過Egr-1特異脫氧核苷酶(EDS)抑制 Egr-I的表達則可以抑制VSMC的增殖，并減少內(nèi)膜的增厚以達到阻止再狹窄的 目的。此外，實驗發(fā)現(xiàn)【151：Egr-I特異誘騙寡核苷酸(decoyODN)治療可以使血管損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增厚、管腔狹窄明顯減輕。 CCNl是以血清或血小板衍生生長因子(PDGF)刺激小鼠BALBc3T3成纖維細胞時發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸(含10的半胱氨酸殘基)蛋白之一【161。其表達

53、受 生長因子、細胞因子、纖溶酶原、糖基化終產(chǎn)物、血流切應(yīng)力以及缺氧等病理刺 激的調(diào)節(jié)【171。CCNl具有多種生物學(xué)功能，如：在體內(nèi)誘導(dǎo)血管形成，支持細胞 黏附，促進細胞遷移、增殖、分化，并能增強生長因子促進成纖維細胞，內(nèi)皮細 胞有絲分裂等作用【l引。在胚胎發(fā)育過程中的血管平滑肌層，成年高血壓大鼠以及 粥樣硬化病變的血管壁中均可發(fā)現(xiàn)CCNl的高表達。研究表明：CCNl的表達與損傷血管處內(nèi)膜增生程度密切相興5】，在血管損傷增生再狹窄過程中可發(fā)現(xiàn)CCNl的高表達，并通過a6151整合素和細胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖血管平滑肌細胞 的粘附，同時刺激血管平滑肌細胞的趨化與遷移【191。TF decoy ODN策略是通過向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)錄因子靶相結(jié)合位點(順式作用 元件)序列相同的人工合成雙鏈寡核甘酸，使其競爭性結(jié)合活化轉(zhuǎn)錄因子