《過(guò)氧化物酶》ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)紅薯過(guò)氧化物酶的制備方法。2.掌握過(guò)氧化物酶的反響原理及測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 1、過(guò)氧化物酶簡(jiǎn)稱POD)簡(jiǎn)介 過(guò)氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光協(xié)作用及生長(zhǎng)素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中它的活性不斷發(fā)生變化。普通老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是由于過(guò)氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，添加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過(guò)氧化物酶的活性添加，所以過(guò)氧化物酶可作為組織老化的一種生理目的。此外，過(guò)氧化物同工酶在遺傳育種中的

2、重要作用也正在遭到注重。 2酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定 (1) 酶活力酶活力 表示酶量的多少不能像普通物質(zhì)那樣，用分量表示酶量的多少不能像普通物質(zhì)那樣，用分量(g)或體積或體積(ml)。由于酶是一種生物催化劑。酶。由于酶是一種生物催化劑。酶的存在和含量多少應(yīng)表達(dá)在催化才干大小，即的存在和含量多少應(yīng)表達(dá)在催化才干大小，即用酶活力用酶活力(活性活性)表示。表示。 酶活力酶活性指酶催化某一特定化學(xué)反響酶活力酶活性指酶催化某一特定化學(xué)反響的才干。催化才干強(qiáng)的才干。催化才干強(qiáng)(大大)，酶活力就高，酶活力就高(大大)，也表示酶量多。酶本身的分量不能闡明酶的實(shí)也表示酶量多。酶本身的分量不能闡明酶的實(shí)踐含量多少。同

3、樣分量的酶，酶活力可以不同，踐含量多少。同樣分量的酶，酶活力可以不同，活力高，價(jià)值就大?；盍Ω?，價(jià)值就大。 (2) 酶促反響速度酶促反響速度 酶活力詳細(xì)用它所催化的某一化學(xué)反響的反響速酶活力詳細(xì)用它所催化的某一化學(xué)反響的反響速度來(lái)表示，即在最適條件下度來(lái)表示，即在最適條件下(最適最適pH、最適、最適T) 酶酶催化的反響速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，催化的反響速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶的活力就愈低。所以測(cè)定酶的活力酶的活力就愈低。所以測(cè)定酶的活力(本質(zhì)上就是本質(zhì)上就是酶的定量酶的定量)測(cè)定就是測(cè)定酶促反響的速度測(cè)定就是測(cè)定酶促反響的速度(用用v表表示示) 。 酶促反響速度可用單位時(shí)

4、間內(nèi)、單位體積中底物酶促反響速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物添加量來(lái)表示。單位：濃度的減少量或產(chǎn)物添加量來(lái)表示。單位：濃度/單位單位時(shí)間時(shí)間 常用產(chǎn)物添加量表示，由于它從無(wú)到有，變化明常用產(chǎn)物添加量表示，由于它從無(wú)到有，變化明顯。酶促反響隨時(shí)間添加，產(chǎn)物添加。顯。酶促反響隨時(shí)間添加，產(chǎn)物添加。 假設(shè)將產(chǎn)物濃度對(duì)反響時(shí)間作圖得到酶促反假設(shè)將產(chǎn)物濃度對(duì)反響時(shí)間作圖得到酶促反響的速度曲線。響的速度曲線。 Vmax時(shí)間時(shí)間產(chǎn)產(chǎn)物物的的生生成成量量斜率濃度斜率濃度/時(shí)間時(shí)間V 從圖可知，反響速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)堅(jiān)從圖可知，反響速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)堅(jiān)持恒定，隨著反響時(shí)間的延伸，酶反響速

5、度持恒定，隨著反響時(shí)間的延伸，酶反響速度逐漸下降。引起下降的緣由很多，如底物濃逐漸下降。引起下降的緣由很多，如底物濃度降低，產(chǎn)物濃度添加而加速了逆反響的進(jìn)度降低，產(chǎn)物濃度添加而加速了逆反響的進(jìn)展，產(chǎn)物對(duì)酶有抑制造用等。因此研討酶反展，產(chǎn)物對(duì)酶有抑制造用等。因此研討酶反響速度以酶促反響的初速度為準(zhǔn)，即酶促反響速度以酶促反響的初速度為準(zhǔn)，即酶促反響最初的一段時(shí)間，產(chǎn)物呈線性添加時(shí)的反響最初的一段時(shí)間，產(chǎn)物呈線性添加時(shí)的反響速度。詳細(xì)指酶促反響速度曲線的斜率。響速度。詳細(xì)指酶促反響速度曲線的斜率。即從原點(diǎn)對(duì)曲線作切線，求切線斜率即從原點(diǎn)對(duì)曲線作切線，求切線斜率( v ) = 濃度濃度 / 時(shí)間時(shí)間

6、由于產(chǎn)物從無(wú)到有，只需方法靈敏，可由于產(chǎn)物從無(wú)到有，只需方法靈敏，可準(zhǔn)確測(cè)定。測(cè)定產(chǎn)物添加量的方法很多：準(zhǔn)確測(cè)定。測(cè)定產(chǎn)物添加量的方法很多： 化學(xué)方法：滴定、比色、氣體測(cè)壓、電化學(xué)方法：滴定、比色、氣體測(cè)壓、電化學(xué)等?；瘜W(xué)等。 物理方法：物理方法：UV吸收、熒光等。吸收、熒光等。 同位素方法等。同位素方法等。 (3) 酶的活力單位酶的活力單位 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的單位表示酶活力大小，也就是酶量的大小的單位稱酶的活力單位稱酶的活力單位(U)。 國(guó)際單位國(guó)際單位(IU)定義：定義：1個(gè)酶活力單位，是指?jìng)€(gè)酶活力單位，是指在特定條件下，在在特定條件下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾

7、微摩爾( mol)底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化1微摩爾底物微摩爾底物中的有關(guān)基團(tuán)的酶量。中的有關(guān)基團(tuán)的酶量。3、測(cè)定原理、測(cè)定原理 過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類的反過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化酚類的反響，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步響，產(chǎn)物為醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實(shí)驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚即愈創(chuàng)化合物。本實(shí)驗(yàn)以鄰甲氧基苯酚即愈創(chuàng)木酚為過(guò)氧化物酶的底物，在此酶存在木酚為過(guò)氧化物酶的底物，在此酶存在下，下，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的的4-鄰甲氧基苯酚，其反響為：鄰甲

8、氧基苯酚，其反響為：本實(shí)驗(yàn)用紫外吸收法測(cè)定產(chǎn)物本實(shí)驗(yàn)用紫外吸收法測(cè)定產(chǎn)物4鄰甲氧基苯酚在鄰甲氧基苯酚在470nm光吸收添加值表示產(chǎn)物添加量，劃出光吸收光吸收添加值表示產(chǎn)物添加量，劃出光吸收 - 時(shí)間的速時(shí)間的速度曲線，求出曲線的斜率，即酶促反響初速度，再換算度曲線，求出曲線的斜率，即酶促反響初速度，再換算為酶活力。為酶活力。42134567800 2 4 6 8反響時(shí)間 分鐘生成物光吸收0.400.300.200.102. pH對(duì)酶促反響速度的影響對(duì)酶促反響速度的影響(1) 影響酶促反響速度的要素影響酶促反響速度的要素* 底物濃度底物濃度 米氏公式米氏公式* 溫度溫度* 酶濃度酶濃度* 激活劑

9、、抑制劑激活劑、抑制劑* pH (2) pH對(duì)酶促反響速度的影響對(duì)酶促反響速度的影響 大多數(shù)酶的活力受其環(huán)境大多數(shù)酶的活力受其環(huán)境pH影響。這是由影響。這是由于于pH影響底物分子和酶分子中一些基團(tuán)的影響底物分子和酶分子中一些基團(tuán)的解離，這些基團(tuán)的離子化形狀關(guān)系究竟物解離，這些基團(tuán)的離子化形狀關(guān)系究竟物與酶的結(jié)合、酶的專注性和酶活性中心的與酶的結(jié)合、酶的專注性和酶活性中心的構(gòu)象。通常各種酶只需在一定構(gòu)象。通常各種酶只需在一定pH范圍內(nèi)才范圍內(nèi)才具有活性，并在一定具有活性，并在一定pH下，酶促反響具有下，酶促反響具有最大反響速度，此最大反響速度，此pH稱最適稱最適pH，高于或低，高于或低于此值反響

10、速度都下降。于此值反響速度都下降。 如將反響速度對(duì)如將反響速度對(duì)pH作曲線，典型的呈鐘罩作曲線，典型的呈鐘罩形，但不同酶受形，但不同酶受pH影響是不同，所以會(huì)有影響是不同，所以會(huì)有不同外形，有的只需鐘罩形的一半，有的那不同外形，有的只需鐘罩形的一半，有的那么是不斷線，即受么是不斷線，即受pH影響不大。影響不大。木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶膽堿脂酶膽堿脂酶 不同酶的最適不同酶的最適pH也不同，如胃蛋白酶為也不同，如胃蛋白酶為pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶為、胰蛋白酶為pH 8。但應(yīng)留意最適。但應(yīng)留意最適pH不是特征常數(shù)，對(duì)于同一種酶，其最適不是特征常數(shù)，對(duì)于同一種酶，其最適pH因底物

11、的種類、濃度及緩沖液成份不同因底物的種類、濃度及緩沖液成份不同而有差別，因此酶的最適而有差別，因此酶的最適pH并不是一個(gè)常并不是一個(gè)常數(shù)，只是在一定條件下才有意義。普通最數(shù)，只是在一定條件下才有意義。普通最適適pH在在6 - 8之間。之間。 由于酶活力受由于酶活力受pH影響很大，因此在測(cè)定酶影響很大，因此在測(cè)定酶活力時(shí)，活力時(shí)，pH必需恒定，所以測(cè)活反響最好必需恒定，所以測(cè)活反響最好在緩沖液體系中進(jìn)展。在緩沖液體系中進(jìn)展。 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定三亇不同本實(shí)驗(yàn)測(cè)定三亇不同pH下過(guò)氧化物酶的下過(guò)氧化物酶的時(shí)間光吸收關(guān)系曲線，比較三亇不同時(shí)間光吸收關(guān)系曲線，比較三亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)條件對(duì)

12、過(guò)氧化物酶活力的條件對(duì)過(guò)氧化物酶活力的影響。影響。三、實(shí)驗(yàn)操作三、實(shí)驗(yàn)操作1、過(guò)氧化物酶粗品液的制備、過(guò)氧化物酶粗品液的制備稱取紅薯資料稱取紅薯資料1g，加少許石英砂及，加少許石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸緩沖液磷酸緩沖液2ml左右左右) ，于研缽中研磨成勻漿。于研缽中研磨成勻漿。再參與再參與3ml磷酸緩沖液浸提磷酸緩沖液浸提20分鐘后，以分鐘后，以6000r/min離心離心15分鐘。分鐘。傾出上清液并過(guò)濾，然后轉(zhuǎn)入傾出上清液并過(guò)濾，然后轉(zhuǎn)入10ml容量瓶容量瓶定容，搖勻后，貯于冷處備用。定容，搖勻后，貯于冷處備用。 2、 酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定 (1)取取1只比色杯洗凈控干，按以下步

13、驟操作：只比色杯洗凈控干，按以下步驟操作： 用移液管汲取用移液管汲取0.1 mol/L反響液反響液(pH 6.0) 2.9mL 參與比色杯中。參與比色杯中。 放入紫外分光光度計(jì)比色杯架內(nèi)，按放入紫外分光光度計(jì)比色杯架內(nèi)，按auto zero，出現(xiàn)插入空白，按出現(xiàn)插入空白，按ok，儀器自動(dòng)調(diào)零。調(diào)零完，儀器自動(dòng)調(diào)零。調(diào)零完成后按成后按start，出現(xiàn)插入樣品。，出現(xiàn)插入樣品。 (2)取出比色杯，取出比色杯，1人加酶液人加酶液(L)，先加，先加20 L ，另另1人同時(shí)按人同時(shí)按ok開(kāi)場(chǎng)計(jì)時(shí)，加酶后蓋上硫酸紙，開(kāi)場(chǎng)計(jì)時(shí)，加酶后蓋上硫酸紙，按緊混勻，按緊混勻，30秒內(nèi)放入比色杯架內(nèi)，儀器每秒內(nèi)放入比色

14、杯架內(nèi)，儀器每30秒自動(dòng)記錄光吸收值秒自動(dòng)記錄光吸收值A(chǔ)470nm。 (3)按數(shù)據(jù)處置中的數(shù)據(jù)打印，顯示按數(shù)據(jù)處置中的數(shù)據(jù)打印，顯示8個(gè)數(shù)據(jù)，個(gè)數(shù)據(jù)，記錄數(shù)據(jù)。記錄數(shù)據(jù)。 (4)操作要點(diǎn)：操作要點(diǎn)： * 關(guān)鍵是酶稀釋的倍數(shù)和酶量多少要適宜，關(guān)鍵是酶稀釋的倍數(shù)和酶量多少要適宜，使使A470nm在在0.20.4/min，即第，即第1個(gè)個(gè)30秒秒A470nm在在0.1- 0.2。過(guò)低過(guò)高都應(yīng)添加或減。過(guò)低過(guò)高都應(yīng)添加或減少酶量重新做。少酶量重新做。 * 加酶后應(yīng)迅速搖勻，立刻計(jì)算時(shí)間，加酶后應(yīng)迅速搖勻，立刻計(jì)算時(shí)間，2人人要配合好，計(jì)時(shí)不能提早或推后，否那么要配合好，計(jì)時(shí)不能提早或推后，否那么曲線不

15、是從原點(diǎn)開(kāi)場(chǎng)。曲線不是從原點(diǎn)開(kāi)場(chǎng)。 * 每次測(cè)定前務(wù)必洗凈比色杯，用去離子水每次測(cè)定前務(wù)必洗凈比色杯，用去離子水沖洗沖洗5遍以上，保證不殘留上次的溶液，否遍以上，保證不殘留上次的溶液，否那么影響測(cè)定。那么影響測(cè)定。四四. 數(shù)據(jù)處置數(shù)據(jù)處置 1. 用坐標(biāo)紙作出時(shí)間用坐標(biāo)紙作出時(shí)間 A470nm曲線，過(guò)原曲線，過(guò)原點(diǎn)在直線部分作切線，求斜率點(diǎn)在直線部分作切線，求斜率A470nm /min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 時(shí)間時(shí)間/min 10.80.60.40.2A470nm 2. 代入下式計(jì)算酶活力代入下式計(jì)算酶活力 A470nm /minV POD活力單位活力單

16、位mol/min= L A470nm /min3 mL = 26.6 mL/ mol cmcm A470nm 3 = (mol/min) 26.6 V 反響液體積反響液體積 ( mL ) 產(chǎn)物產(chǎn)物4鄰甲氧基苯酚的摩爾消光系數(shù)鄰甲氧基苯酚的摩爾消光系數(shù)26.6 L/ mmolcm 即即26.6 mL/ molcm) L 比色杯光徑比色杯光徑 (1cm)實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 POD蛋白濃度測(cè)定蛋白濃度測(cè)定 和比活力計(jì)算和比活力計(jì)算 一一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1.學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)Folin酚法酚法Lowry法測(cè)法測(cè)定定POD蛋白濃度的原理和方法蛋白濃度的原理和方法 2.掌握比活力計(jì)算方法掌握比活力計(jì)算方法二二.實(shí)驗(yàn)原

17、理實(shí)驗(yàn)原理1Folin酚法原理酚法原理 Folin酚試劑由兩種試劑組成：酚試劑由兩種試劑組成： 甲試劑：雙縮脲試劑甲試劑：雙縮脲試劑 尿素加熱至尿素加熱至180左右，兩分子尿素縮左右，兩分子尿素縮合放出一分子氨，而構(gòu)成雙縮脲。合放出一分子氨，而構(gòu)成雙縮脲。 NH2 NH2 C = O C = O NH2 180 NH + NH3 NH2 C = O C = O NH2 NH2 雙縮脲在堿性溶液中與銅離子酒雙縮脲在堿性溶液中與銅離子酒石酸鉀鈉石酸鉀鈉-CuSO4絡(luò)合生成復(fù)雜絡(luò)合生成復(fù)雜的紫紅色化合物。的紫紅色化合物。 蛋白質(zhì)分子中的肽鍵蛋白質(zhì)分子中的肽鍵CONH與雙縮脲構(gòu)造類似，也有與雙縮脲構(gòu)造

18、類似，也有雙縮脲反響，其顏色深淺與蛋白質(zhì)雙縮脲反響，其顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此一切蛋白質(zhì)或的含量成正比，因此一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反響，二肽以上的多肽都有雙縮脲反響，可用作蛋白質(zhì)定性、定量分析?？捎米鞯鞍踪|(zhì)定性、定量分析。 甲試劑本質(zhì)是利用蛋白質(zhì)中肽甲試劑本質(zhì)是利用蛋白質(zhì)中肽鍵反響進(jìn)展定量測(cè)定，它與蛋鍵反響進(jìn)展定量測(cè)定，它與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸組成無(wú)關(guān)，白質(zhì)分子量及氨基酸組成無(wú)關(guān)，即受蛋白質(zhì)氨基酸的特異性影即受蛋白質(zhì)氨基酸的特異性影響較少。但靈敏度較低，響較少。但靈敏度較低，mg級(jí)級(jí)程度，程度，010 mg/mL作規(guī)范曲線。作規(guī)范曲線。 乙試劑：主要起作用是磷鉬酸磷鎢酸

19、，它由鉬酸鈉乙試劑：主要起作用是磷鉬酸磷鎢酸，它由鉬酸鈉鎢酸鈉在酸性磷酸等作用下產(chǎn)生。鎢酸鈉在酸性磷酸等作用下產(chǎn)生。 鉬酸鈉鎢酸鈉鉬酸鈉鎢酸鈉 HCl 堿性堿性 H3PO4 + 鉬酸鎢酸鉬酸鎢酸 磷鉬酸磷鉬酸 鉬蘭鎢蘭鉬蘭鎢蘭 磷鎢酸復(fù)原劑磷鎢酸復(fù)原劑 H3PO4 + 12H2MoO4 H3Mo12PO40 + 12H2O 堿性復(fù)原劑 Mo2O3MoO3 蘭色 Folin酚試劑最初由Folin等于1912年提出，當(dāng)時(shí)只需乙試劑運(yùn)用于酚類測(cè)定，以后才用于蛋白質(zhì)測(cè)定。由于Tyr的酚基也能起復(fù)原劑作用，呈蘭色反響，因此被利用于測(cè)定蛋白質(zhì)，產(chǎn)物顏色深淺與被測(cè)蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系，所以乙試劑作用是利用蛋

20、白質(zhì)中Tyr、Try、Cys等具有復(fù)原性的氨基酸殘基的作用進(jìn)展測(cè)定，靈敏度高，但是后來(lái)發(fā)現(xiàn)有些缺陷，出現(xiàn)不少改良方法。 1951年年Lowry勞里在勞里在 Folin酚試劑酚試劑 中引入雙縮脲反響參與甲試劑即成中引入雙縮脲反響參與甲試劑即成為如今廣泛被運(yùn)用的為如今廣泛被運(yùn)用的Lowry法。法。 為什么要作這樣改良？為什么要作這樣改良？ Folin酚試劑中只需乙試劑，依賴蛋白質(zhì)酚試劑中只需乙試劑，依賴蛋白質(zhì)中中Tyr、Trp等氨基酸殘基的反響，而對(duì)等氨基酸殘基的反響，而對(duì)于不同種類蛋白質(zhì)，由于它們之間的氨于不同種類蛋白質(zhì)，由于它們之間的氨基酸組成不同，在呈色反響中就會(huì)有差基酸組成不同，在呈色反響

21、中就會(huì)有差別，影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，即受蛋白質(zhì)特性別，影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度，即受蛋白質(zhì)特性影響較大，而雙縮脲試劑是利用肽鍵反影響較大，而雙縮脲試劑是利用肽鍵反響，不受氨基酸組成的影響。響，不受氨基酸組成的影響。 引入雙縮脲試劑后，具有兩種試劑雙重引入雙縮脲試劑后，具有兩種試劑雙重作用，相互補(bǔ)充，結(jié)果大大添加了反作用，相互補(bǔ)充，結(jié)果大大添加了反響的靈敏度和準(zhǔn)確度。響的靈敏度和準(zhǔn)確度。Lowry法較雙縮法較雙縮脲靈敏度提高脲靈敏度提高100倍，較倍，較UV法靈敏法靈敏1020倍。倍。 Folin酚酚Lowry法，靈敏度高，操法，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，迅速，不需求特殊儀器，常作簡(jiǎn)單，迅速，不需求特殊儀器，常用作蛋

22、白質(zhì)定量測(cè)定，文獻(xiàn)援用最多。用作蛋白質(zhì)定量測(cè)定，文獻(xiàn)援用最多。 方法方法 靈敏度靈敏度 時(shí)間時(shí)間 原理原理 干擾物質(zhì)干擾物質(zhì) 闡明闡明凱氏定氮法凱氏定氮法Kjedahl法法靈敏度低，適靈敏度低，適用于用于0.21.0mg/ml氮，誤差為氮，誤差為 2費(fèi)時(shí)費(fèi)時(shí) 810小時(shí)小時(shí)蛋白質(zhì)平均含氮蛋白質(zhì)平均含氮量量16經(jīng)過(guò)硫酸經(jīng)過(guò)硫酸消化，強(qiáng)堿堿化，消化，強(qiáng)堿堿化，吸收并滴定，準(zhǔn)確吸收并滴定，準(zhǔn)確測(cè)定氮量測(cè)定氮量非蛋白氮可用非蛋白氮可用三氯乙酸沉淀蛋三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分別白質(zhì)而分別用于規(guī)范蛋白質(zhì)用于規(guī)范蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)時(shí)太長(zhǎng)雙縮脲法雙縮脲法Biuret法

23、法靈敏度低靈敏度低310nm比色比色0.11.0mg/ml540nm比色比色110mg/ml中速中速 2030分鐘分鐘多肽鍵堿性多肽鍵堿性Cu2紫色絡(luò)合紫色絡(luò)合物物硫酸銨；硫酸銨；Tris緩沖液；緩沖液；某些氨基酸某些氨基酸用于快速測(cè)定，用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相同蛋白質(zhì)顯色相似似紫外吸收法紫外吸收法較為靈敏較為靈敏0.11.0mg/ml快速快速 510分鐘分鐘蛋白質(zhì)中的酪氨酸蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在和色氨酸殘基在280nm處的光吸收處的光吸收各種嘌吟和嘧各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸啶；各種核苷酸用于層析柱流出用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸液的檢測(cè)；核酸的吸收可

24、以校正的吸收可以校正Folin酚試劑酚試劑法法Lowry法法靈敏度高靈敏度高0.035g慢速慢速 4060分鐘分鐘雙縮脲反響；磷鉬雙縮脲反響；磷鉬酸磷鎢酸試劑被酸磷鎢酸試劑被Tyr和和Phe復(fù)原復(fù)原硫酸銨；硫酸銨；Tris緩沖液；緩沖液；甘氨酸；甘氨酸；各種硫醇各種硫醇耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)厲計(jì)時(shí)；作要嚴(yán)厲計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同顏色深淺隨不同蛋白量變化蛋白量變化考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法法)靈敏度最高靈敏度最高15g快速快速515分鐘分鐘考馬斯亮藍(lán)染料與考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其max由由465nm變變?yōu)闉?95nm強(qiáng)堿性緩沖液；強(qiáng)堿性緩沖液；

25、TritonX-100;SDS 最好的方法；最好的方法； 干擾物質(zhì)少；干擾物質(zhì)少； 顏色穩(wěn)定；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同顏色深淺隨不同蛋白量變化蛋白量變化2、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 3.比活力概念比活力概念 比較不同分量或不同蛋白含量的酶活力并無(wú)實(shí)踐比較不同分量或不同蛋白含量的酶活力并無(wú)實(shí)踐意義，不同酶或同一種酶在不同情況下的比較應(yīng)意義，不同酶或同一種酶在不同情況下的比較應(yīng)有一個(gè)分量規(guī)范，于是產(chǎn)生出另一個(gè)酶的重要參有一個(gè)分量規(guī)范，于是產(chǎn)生出另一個(gè)酶的重要參數(shù)數(shù)比活力。比活力。 比活力比活力 指單位質(zhì)量的酶蛋白所具有的酶活力指單位質(zhì)量的酶蛋白所具有的酶活力 單位單位 酶活力單位酶活力

26、單位 / mg酶蛋白酶蛋白 ( IU / mg酶蛋酶蛋白白 ) 比活力是酶學(xué)研討及酶制劑消費(fèi)制備中經(jīng)常運(yùn)用比活力是酶學(xué)研討及酶制劑消費(fèi)制備中經(jīng)常運(yùn)用的數(shù)據(jù)，用來(lái)比較單位分量酶蛋白的催化才干的數(shù)據(jù)，用來(lái)比較單位分量酶蛋白的催化才干( 即即酶活力大小酶活力大小 )。 比活力實(shí)踐意義比活力實(shí)踐意義 可以闡明酶的質(zhì)量好壞，純度高可以闡明酶的質(zhì)量好壞，純度高低。不同酶比較時(shí)，比活力高，闡明其質(zhì)量好，低。不同酶比較時(shí)，比活力高，闡明其質(zhì)量好，純度高；對(duì)同一種酶，可以比較不同批次的質(zhì)量純度高；對(duì)同一種酶，可以比較不同批次的質(zhì)量和純度。在酶的消費(fèi)制備過(guò)程，調(diào)查比活力尤為和純度。在酶的消費(fèi)制備過(guò)程，調(diào)查比活力尤

27、為重要，隨著該酶不斷被提純，它的比活力升高，重要，隨著該酶不斷被提純，它的比活力升高，闡明酶逐漸被純化，比如，粗制品總活力很高，闡明酶逐漸被純化，比如，粗制品總活力很高，蛋白質(zhì)含量也很高蛋白質(zhì)含量也很高(雜蛋白多雜蛋白多)，比活力低。純化后，比活力低。純化后雖然總活力降低，但蛋白質(zhì)含量也因大量雜蛋白雖然總活力降低，但蛋白質(zhì)含量也因大量雜蛋白被除去而減少，使比活力升高。酶愈純，比活力被除去而減少，使比活力升高。酶愈純，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相當(dāng)純了，因此比愈高，比活力不再升高，酶就相當(dāng)純了，因此比活力用以衡量消費(fèi)工藝優(yōu)劣、消費(fèi)效率高低。它活力用以衡量消費(fèi)工藝優(yōu)劣、消費(fèi)效率高低。它是一個(gè)

28、很有實(shí)踐用途的參數(shù)，是經(jīng)常要測(cè)定的數(shù)是一個(gè)很有實(shí)踐用途的參數(shù)，是經(jīng)常要測(cè)定的數(shù)據(jù)。據(jù)。三、操作步驟三、操作步驟每人取每人取16支試管，按下表平行支試管，按下表平行操作：操作：12345678規(guī)范蛋白質(zhì)溶液規(guī)范蛋白質(zhì)溶液/mL 00.10.20.30.40.5待測(cè)蛋白質(zhì)溶液待測(cè)蛋白質(zhì)溶液/mL 0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲試劑甲試劑/mL /mL 2.52.52.52.52.52.52.52.5混勻，于室溫放置混勻，于室溫放置10min 10min 乙試劑乙試劑/mL /mL 0.250.250.250.250.250.250.250.25迅速混勻，室溫放置迅速混勻，室溫放置30min30min后，以后，以dH2OdH2O為空白，在為空白，在640nm640nm處比色處比色 A640nm(1) A640nm (2) A640nm * 規(guī)范蛋白質(zhì)溶液為牛血清清蛋白規(guī)范蛋白質(zhì)溶液為牛血清清蛋白 ( 150g/mL )。* 侍測(cè)樣品侍測(cè)樣品x為為POD酶原液，悄然倒置搖勻后酶原液，悄然倒置搖勻后用