醬檢測(cè)菌落總數(shù)的測(cè)定

1、醬檢測(cè)菌落總數(shù)的測(cè)定執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)： GB4789.2 2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定1 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱（36 ± 1 ， 30 ± 1 ）、冰箱（ 2 5 ）、恒溫水浴箱（46 ± 1 ）、天平（感量為0.1 g）、均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管1 mL（具 0.01mL 刻度）、 10 mL（具 0.1mL 刻度）或微量移液器及吸頭 、無菌錐形瓶（容量250 mL、500mL）、無菌培養(yǎng)皿（直徑90 mm）、 pH 計(jì)或 pH 比色管或精密pH 試紙、放大鏡或 / 和菌落計(jì)數(shù)器2 培養(yǎng)基

2、和試劑2.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。2.2磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.2。2.3無菌生理鹽水：見附錄A中A.3。第1頁(yè)共10頁(yè)3 檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖 1。圖 1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序4 操作步驟4.1樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000 r/min均質(zhì) 1 min2 min，或放入盛有225 mL 稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 2 min ，制成 1:10的樣品勻液。液體樣品： 以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌

3、錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用 1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管第2頁(yè)共10頁(yè)或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按 操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次 1 mL 無菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè) 3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液 （液體樣品可包括原液） ，在進(jìn)行 10倍遞增稀釋時(shí)，吸取 1 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL

4、空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。及時(shí)將 15 mL 20 mL 冷卻至 46的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46± 1 恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。4.2培養(yǎng)待瓊脂凝固后， 將平板翻轉(zhuǎn)， 36 ± 1 培養(yǎng)48 h± 2 h。水產(chǎn)品 30± 1 培養(yǎng)72 h ± 3 h 。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落第3頁(yè)共10頁(yè)時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4 mL ），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按條件進(jìn)行培養(yǎng)。4.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落

5、計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits ，CFU）表示。選取菌落數(shù)在30 CFU300 CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條第4頁(yè)共10頁(yè)單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。5 結(jié)果與報(bào)告5.1菌落總數(shù)的計(jì)算方法若只有一

6、個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每 g （ mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（ 1）計(jì)算：N= C/(n 1+0.1n 2)d（ 1）式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。第5頁(yè)共10頁(yè)示例：稀釋度1:100 （第一稀釋1:1000 （第二稀釋度）度）菌落數(shù)（ CFU）232,24433,35N= C/(n 1+0.1n 2)d=(232+244+3

7、3+35)/2+(0.1× 2) ×10-2 =544/0.022=24727上述數(shù)據(jù)按數(shù)字修約后，標(biāo)示為25000 或 2.5 × 104若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU ，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長(zhǎng)，第6頁(yè)共10頁(yè)則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU 或大于

8、 300 CFU 時(shí)，則以最接近30 CFU或 300 CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。5.2菌落總數(shù)的報(bào)告菌落數(shù)小于100 CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100 CFU時(shí)，第 3 位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10 的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL 為單位報(bào)告。第7頁(yè)共10頁(yè)附錄 A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1平板計(jì)數(shù)瓊脂（plat

9、e count agar， PCA）培養(yǎng)基成分胰蛋白胨5.0 g酵母浸膏2.5 g葡萄糖1.0 g瓊 脂15.0 g蒸餾水1000 mLpH 7.0 ±0.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶， 121高壓滅菌15 min 。A.2磷酸鹽緩沖液第8頁(yè)共10頁(yè)成分磷酸二氫鉀（ KH2PO4）34.0 g蒸餾水500 mLpH 7.2制法貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL 蒸餾水中，用大約 175 mL的 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL 后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25 mL ，用蒸餾水稀釋至1 000 mL ，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌15 min 。A.2磷酸鹽緩沖液成分磷酸二氫鉀（ KH2PO4）34.0 g蒸餾水500 mLpH 7.2第9頁(yè)共10頁(yè)制法貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL 蒸餾水中，用大約 175 mL的 1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1 000 mL