基因工程第4-6章復習題1

1、第4-6章復習題一、真空題1、用于PCR反應的耐熱聚合酶有 、 、 、 、 等。2、基因工程實驗中常用到一些有毒、致癌、致畸試劑，這些試劑有 、 、 等。3、根據雜交對象的不同，分子雜交可分為 、 、 、 。4、用于電泳別離DNA或RNA的凝膠有 、 其中 可區(qū)分1bp的DNA。5、外源DNA導入宿主的方法有 、 、 、 等。二、問答題1、 核酸電泳的基本原理是什么？主要有哪幾種凝膠電泳？各有什么用途？2、什么叫Sanger測序法，簡述手動Sanger測序的操作步驟。3、什么是Southern hybirdization？簡述其基本過程？4、什么是Northern hybirdization？

2、5、什么是原位雜交？6、什么是Western hybirdization？7、什么是探針？如何標記探針？8、什么是transformation？9、什么是transduction？10、簡述PCR的基本原理和反應過程？11、耐熱DNA聚合酶的種類和活性？12、什么是PCR平臺效應？13、什么是寡聚核苷酸芯片？簡述其工作原理？14、試述基因克隆的基本步驟？15、什么是基因文庫、cDNA文庫？16、簡述用BAC載體構建基因文庫的操作步驟？17、什么是mRNA豐度18、簡述置換引導法合成cDNA第二鏈的原理？19、什么是DNA多態(tài)性？20、RFLP的基本原理？21、什么是SSR？22、AFLP的基本

3、原理？23、什么是RAPD？24、有兩個雜交親本，其雜交后代為F1，請用所學分子標記的基本原理設計一個實驗，鑒定F1代的純度。25、什么是差異雜交、什么是扣除雜交？26、什么是mRNA差異顯示法？如何利用mRNA差異顯示法篩選目標基因？27、什么是酵母雙雜交體系？28、基因工程實驗中會用到哪些高毒、致癌、致畸試劑？29、已知某一基因的所表達蛋白質的氨基酸序列，如何克隆到該基因？30、建立一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克?。?1、T cell和B cell 來自于一種前體細胞，且都能識別特異性抗原，但T cell 只能說別外表抗原，其原因是T cell中含有一種由ter基因表達的TC

4、R蛋白。你采用何種方法能克隆到ter基因？32、在野生的擬南芥中發(fā)現一種特抗炭疽病的植株，且抗病性是由單一基因控制的，試問采用何種方法能克隆到此抗炭疽病的基因？33、基因克隆是如何使含有單個基因的DNA片段得到純化的？34、當兩種限制性內切酶的作用條件不同時，假設進行雙酶切，應采取什么措施？為什么？35、已知某一細菌的一個ORF，但不知其是否有基因產物，試述采用什么方法可驗證是否有其基因產物。36、說明基因芯片的工作原理及其在生物學研究中的意義37、隨機引物標記DNA探針的原理和方法？38、什么叫PCR？PCR為什么會出現平臺現象？39、已知某一物種的某一基因表達的蛋白質氨基酸序列組成，試述克

5、隆該基因的方法和具體步驟。40、試述用YAC構建一種大豆基因組文庫的方法。41、試述用gt10構建一種大豆花期葉片cDNA文庫的方法？ 42、下列圖是Sanger Sequencing PAGE部分電泳結果示意圖，試讀取堿基系列53并簡述測序原理43、已知水稻某特性由某一個單基因控制，試述用Ac-Ds轉座子標簽法克隆該基因的原因和方法。44、禾轂類蛋白質的賴氨酸和色氨酸含量低，現擬用基因工程方式改變禾轂類蛋白質氨基酸不平衡的狀態(tài)，試述其實驗方案。45、打算將一個cDNA克隆到一個表達載體，以便在E.coli中大量制備相應的蛋白質。這個cDNA的兩側具有BamHI的位點，因此計劃將它從BamHI

6、的位點插入載體中。實驗嚴格地按照克隆手冊中的方法進行：載體用BamHI切割后，立即用堿性磷酸酶處理，除去5磷酸。接著將處理過的載體同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA連接酶后進行溫育，連接以后，將DNA同已處理過的可以接受DNA的細菌感受態(tài)細胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以轉化的細菌能夠存活。實驗中同時設置了4個對照： 對照1： 將未同任何載體接觸過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對照2： 將未切割載體轉化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對照3： 將經切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉

7、化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對照4： 將經切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用DNA連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉化過的細菌細胞涂布在培養(yǎng)平板上。 在進行第一次實驗時，感受態(tài)細胞不是自己制備的，結果，在所有的平板上都長出了多到無法計數的菌落(表)。在第二次實驗中，自己制備感受態(tài)細胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長(表)。接著又進行了第三次實驗，這次得到了轉化子(表)。從實驗平板上挑出12個菌落，別離了質粒DNA，并用BamH I進行切割，其中9個克隆產生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個克隆中切出一個cDNA片段，實驗終于獲得成功。(1)你如何看待第一次的實驗結果?對照1的

8、目的是什么? (2)影響第二次實驗結果的原因是什么?對照2的作用何在？ (3)對照3和4各有什么作用? (4)為什么要用堿性磷酸酶處理載體?46、打算在細菌中表達一種稀有的人類某種蛋白質，以便能夠大量制備這種蛋白。為確保別離純化，決定將一段6個組氨酸的短肽加到該蛋白質的N端或C端。這些帶有組氨酸標簽的蛋白質能夠緊緊地同Ni2+柱結合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脫。此法可以一步完成大量蛋白質的純化。 圖1是編碼該蛋白的核苷酸序列。請設計一對PCR引物，各含有18個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列，另外，在N端有一個起始密碼，其后是6個組氨酸密碼子。另設計一對引物，能夠在C端

9、加上6個組氨酸和一個終止密碼。47、YES(酵母大腸桿菌穿梭載體)是構建cDNA文庫的高效載體，這種載體是噬菌體基因組與一個在大腸桿菌和酵母中都能復制的質粒巧妙結合而成，它兼有病毒和質粒載體的優(yōu)點。 cDNA被插入載體的質粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來的載體感染大腸桿菌的效率比質粒本身要高得多。一旦進入了大腸桿菌，YES中的質粒序列能夠被誘導重組出入基因組，并進行獨立復制，這就可以從質粒中別離出來，以便進行進一步的遺傳操作。為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個切點的限制性內切核酸酶XhoI (5CTCGAG)進行切割，然后在dTT P存在的情況下，同DNA聚合酶一起進

10、行溫育。將一種具有平末端的雙鏈cDNA同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5CGAGATTTACC和5GGTAAATC，它們的5端都是磷酸。然后將載體和cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用2g的載體和0.1g的cDNA，構建了一個有4×107個克隆的cDNA文庫。問: (1)假定載體長為43kb，cDNA的平均長度是lkb，請估計在連接混合物中，載體分子同cDNA的比例是多少? (2)在此過程中，載體分子轉變成重組體的頻率是多少(每對核苷酸的平均分子量是 660Da)? (3)說明怎樣處理載體和cDNA分子，才能把它們連接到一起。處

11、理過的載體本身能自連嗎?cDNA呢? (4)載體和cDNA分子要經過怎樣的處理才能提高產生重組DNA分子的效率? (5)能夠用XhoI從重組質粒中切出cDNA嗎?48、如何以大腸桿菌質粒DNA為載體克隆一個編碼動物激素的基因，并使之在大腸桿菌中進行表達?簡要說明實驗中可能遇到的問題及可能的解決方法。49、一個人類疾病基因被定位在7號染色體一段140kb的區(qū)域內，并已別離到此染色體區(qū)段的克隆，但是并不知道該基因定位在此區(qū)域的哪一位置?？捎檬裁捶椒ㄕ业皆摶?50、種子在儲藏過程中發(fā)生了某種變化，使得長成的水稻很容易被一種病原菌感染。據推測可能是某一化學誘導的突變導致一個具有抗菌功能的關鍵酶喪失。

12、請設計一個實驗驗證這種推測是否正確，如何使種子重新獲得對這種病的抗性? 51、從E.coli中別離到一種hemA突變體，這種突變是不可恢復的，并且需要生長在琥珀酸的平板上才能利用6氨基乙酰丙酸合成血紅素。希望利用該突變體去克隆E.coli 的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均為2kb，然后將這些片段從BamH I位點克隆到質粒pBR322中，連接后轉化hemA突變體.根據氨芐青霉素抗性來選擇重組體。將篩選到的氨芐青霉素抗性克隆重植在加有氨基乙酰丙酸的平板上進行測試。請問：已經測試的Ampr抗性轉化子中有多少不再需要在培養(yǎng)基中添加琥珀酸? (E.co

13、li基因組的全長為4500kb)52、在基因工程中，為了在細菌細胞中表達真核生物的基因產物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細菌的啟動子?53、你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據方案，下面一步驟是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。為了節(jié)省時間，你略過了這一步，直接將DNA從凝膠轉至硝酸纖維素膜上。然后用標記探針雜交，最后發(fā)現放射自顯影片是空白。錯在哪里?54、為了大量獲得許多用于生化鑒定的產物，你想將擬南芥中的一個序列已知、編碼單體酶蛋白的基因在單細胞微生物中表達，你如何確保最終能得到產物? 55、假定你別離到一個E.c

14、oli的Thy突變體，并推測有可能是Thy A基因突變。請設計一個方案用PCR從染色體DNA擴增突變的Thy A基因，測定突變的序列。(注：E.coli野生型的Thy A基因的序列是已知的)56、PCR反應同大腸桿菌體內的DNA復制有哪些不同?你認為根本的差異在哪里？57、在古生物學中，尚不知道恐龍是否是溫血爬行動物，而不像今天的變溫爬行動物。 假設你得到一些恐龍的DNA，你如何通過PCR和基因克隆來檢測恐龍是否是溫血爬行動物?58、你打算擴增下列圖所示的兩段序列之間的DNA，請從所列出的引物中選出合適的一對？5GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG3 3CTGGACACCTTCG

15、GTATGCCCTAAC 5 引物1 引物2 5GACCTGTGGAAGC 5 CATACGGGATTG 5CTGGACACCTTCG 5GTATGCCCTAAC 5CGAAGGTGTCCAG 5 GTTAGGGCATAC5GCTTCCACCGGTC 5CAATCCCGTATG59、假定你從黏質沙雷氏菌中克隆了一個基因，并推測可能是依賴于鋅的金屬蛋白酶，因為它含有兩個組氨酸和一個谷氨酸與鋅形成鋅指結構。請你設計一個方案，改變其中一個組氨酸看看是否改變蛋白酶的活性?60、你打算將一個具有末端的DNA片段克隆到具有BamH I 末端的載體中。問題是BamH I和Kpn I的末端是不匹配的，BamH

16、 I 是5突出端，Kpn I則是突出的3 端(圖)。一位朋友建議用下列圖所示的寡聚核苷酸“片段”來進行連接。你并沒有馬上意識到達種方法是可行，因為你想到的連接作用需要鄰近的5磷酸和3羥基。雖然寡聚核苷酸分子被限制性內切核酸酶切割后會產生合適的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羥基。另外，雖然下列圖中接頭是及BamH I Kpn I ，但另一個接頭卻是Kpn IBamH I，你疑心相同的寡聚核苷酸是否能夠適合這兩種方式的連接。 (1)畫出Kpn IBamH I結合體和所需要的寡聚核苷酸片段的圖，這種寡聚核苷酸與下列圖所示的是否相同? (2)畫出用連接酶處理過的分子圖，指明被連接的缺口。(3)

17、你朋友的圖解方法有效嗎? 61、一個癌基因，從序列上看似乎編碼一個轉錄因子。當放在細胞中表達時，該基因的產物是完全不溶的，這阻礙了對其功能的直接檢測，免疫染色說明，這種蛋白定位于細胞核內，如同推測的一樣，是一種轉錄因子。如果能夠測出它所結合的DNA序列，就可以通過現有的序列資料中查找已知基因啟動子的天然位點，從而能夠找到它所調節(jié)的基因。有人建議用PCR擴增同該蛋白結合的微量DNA，思路(下列圖)是：(1)合成一組長為26個堿基的隨機序列的寡聚核苷酸混合體，在該序列的兩側各有一段25個堿基的序列作為PCR擴增的引物位點(圖A)；(2)把這些寡聚核苷酸加到含有轉錄因子的細胞粗提取物中，轉錄因子可以同含有結合位點的寡聚核苷酸結合；(3)用轉錄因子特異的抗體別離同轉錄因子結合的寡聚核苷酸；(4)用PCR擴增選擇到的寡聚核苷酸進行序列分析。按照這一思路，用0.2ng單鏈隨機序列的寡聚核苷酸開始了這項實驗，這個寡聚核苷酸可以同一個PCR引物結合成部分雙鏈，經過如圖B