基因工程第4-6章復(fù)習(xí)題1

1、第4-6章復(fù)習(xí)題一、真空題1、用于PCR反應(yīng)的耐熱聚合酶有 、 、 、 、 等。2、基因工程實(shí)驗(yàn)中常用到一些有毒、致癌、致畸試劑，這些試劑有 、 、 等。3、根據(jù)雜交對(duì)象的不同，分子雜交可分為 、 、 、 。4、用于電泳別離DNA或RNA的凝膠有 、 其中 可區(qū)分1bp的DNA。5、外源DNA導(dǎo)入宿主的方法有 、 、 、 等。二、問(wèn)答題1、 核酸電泳的基本原理是什么？主要有哪幾種凝膠電泳？各有什么用途？2、什么叫Sanger測(cè)序法，簡(jiǎn)述手動(dòng)Sanger測(cè)序的操作步驟。3、什么是Southern hybirdization？簡(jiǎn)述其基本過(guò)程？4、什么是Northern hybirdization？

2、5、什么是原位雜交？6、什么是Western hybirdization？7、什么是探針？如何標(biāo)記探針？8、什么是transformation？9、什么是transduction？10、簡(jiǎn)述PCR的基本原理和反應(yīng)過(guò)程？11、耐熱DNA聚合酶的種類和活性？12、什么是PCR平臺(tái)效應(yīng)？13、什么是寡聚核苷酸芯片？簡(jiǎn)述其工作原理？14、試述基因克隆的基本步驟？15、什么是基因文庫(kù)、cDNA文庫(kù)？16、簡(jiǎn)述用BAC載體構(gòu)建基因文庫(kù)的操作步驟？17、什么是mRNA豐度18、簡(jiǎn)述置換引導(dǎo)法合成cDNA第二鏈的原理？19、什么是DNA多態(tài)性？20、RFLP的基本原理？21、什么是SSR？22、AFLP的基本

3、原理？23、什么是RAPD？24、有兩個(gè)雜交親本，其雜交后代為F1，請(qǐng)用所學(xué)分子標(biāo)記的基本原理設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，鑒定F1代的純度。25、什么是差異雜交、什么是扣除雜交？26、什么是mRNA差異顯示法？如何利用mRNA差異顯示法篩選目標(biāo)基因？27、什么是酵母雙雜交體系？28、基因工程實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到哪些高毒、致癌、致畸試劑？29、已知某一基因的所表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，如何克隆到該基因？30、建立一個(gè)基因文庫(kù)后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克??？31、T cell和B cell 來(lái)自于一種前體細(xì)胞，且都能識(shí)別特異性抗原，但T cell 只能說(shuō)別外表抗原，其原因是T cell中含有一種由ter基因表達(dá)的TC

4、R蛋白。你采用何種方法能克隆到ter基因？32、在野生的擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種特抗炭疽病的植株，且抗病性是由單一基因控制的，試問(wèn)采用何種方法能克隆到此抗炭疽病的基因？33、基因克隆是如何使含有單個(gè)基因的DNA片段得到純化的？34、當(dāng)兩種限制性內(nèi)切酶的作用條件不同時(shí)，假設(shè)進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施？為什么？35、已知某一細(xì)菌的一個(gè)ORF，但不知其是否有基因產(chǎn)物，試述采用什么方法可驗(yàn)證是否有其基因產(chǎn)物。36、說(shuō)明基因芯片的工作原理及其在生物學(xué)研究中的意義37、隨機(jī)引物標(biāo)記DNA探針的原理和方法？38、什么叫PCR？PCR為什么會(huì)出現(xiàn)平臺(tái)現(xiàn)象？39、已知某一物種的某一基因表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列組成，試述克

5、隆該基因的方法和具體步驟。40、試述用YAC構(gòu)建一種大豆基因組文庫(kù)的方法。41、試述用gt10構(gòu)建一種大豆花期葉片cDNA文庫(kù)的方法？ 42、下列圖是Sanger Sequencing PAGE部分電泳結(jié)果示意圖，試讀取堿基系列53并簡(jiǎn)述測(cè)序原理43、已知水稻某特性由某一個(gè)單基因控制，試述用Ac-Ds轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆該基因的原因和方法。44、禾轂類蛋白質(zhì)的賴氨酸和色氨酸含量低，現(xiàn)擬用基因工程方式改變禾轂類蛋白質(zhì)氨基酸不平衡的狀態(tài)，試述其實(shí)驗(yàn)方案。45、打算將一個(gè)cDNA克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在E.coli中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA的兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從BamHI

6、的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用BamHI切割后，立即用堿性磷酸酶處理，除去5磷酸。接著將處理過(guò)的載體同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接以后，將DNA同已處理過(guò)的可以接受DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照： 對(duì)照1： 將未同任何載體接觸過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對(duì)照2： 將未切割載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對(duì)照3： 將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒(méi)有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)

7、化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對(duì)照4： 將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過(guò))并用DNA連接酶連接(但沒(méi)有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上。 在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無(wú)法計(jì)數(shù)的菌落(表)。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)(表)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子(表)。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落，別離了質(zhì)粒DNA，并用BamH I進(jìn)行切割，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。(1)你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?對(duì)照1的

8、目的是什么? (2)影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么?對(duì)照2的作用何在？ (3)對(duì)照3和4各有什么作用? (4)為什么要用堿性磷酸酶處理載體?46、打算在細(xì)菌中表達(dá)一種稀有的人類某種蛋白質(zhì)，以便能夠大量制備這種蛋白。為確保別離純化，決定將一段6個(gè)組氨酸的短肽加到該蛋白質(zhì)的N端或C端。這些帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)能夠緊緊地同Ni2+柱結(jié)合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脫。此法可以一步完成大量蛋白質(zhì)的純化。 圖1是編碼該蛋白的核苷酸序列。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，各含有18個(gè)同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴(kuò)增該基因的編碼序列，另外，在N端有一個(gè)起始密碼，其后是6個(gè)組氨酸密碼子。另設(shè)計(jì)一對(duì)引物，能夠在C端

9、加上6個(gè)組氨酸和一個(gè)終止密碼。47、YES(酵母大腸桿菌穿梭載體)是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的高效載體，這種載體是噬菌體基因組與一個(gè)在大腸桿菌和酵母中都能復(fù)制的質(zhì)粒巧妙結(jié)合而成，它兼有病毒和質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)。 cDNA被插入載體的質(zhì)粒部分，然后它能在體外被包裝入病毒顆粒中，包裝起來(lái)的載體感染大腸桿菌的效率比質(zhì)粒本身要高得多。一旦進(jìn)入了大腸桿菌，YES中的質(zhì)粒序列能夠被誘導(dǎo)重組出入基因組，并進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，這就可以從質(zhì)粒中別離出來(lái)，以便進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。為了最大限度地提高克隆效率，載體用只有一個(gè)切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶XhoI (5CTCGAG)進(jìn)行切割，然后在dTT P存在的情況下，同DNA聚合酶一起進(jìn)

10、行溫育。將一種具有平末端的雙鏈cDNA同一段含由兩段寡聚核苷酸組成的雙鏈寡聚核苷酸接頭連接起來(lái)，這兩段寡聚核苷酸的序列是：5CGAGATTTACC和5GGTAAATC，它們的5端都是磷酸。然后將載體和cDNA混合并連接在一起。采用這種方法用2g的載體和0.1g的cDNA，構(gòu)建了一個(gè)有4×107個(gè)克隆的cDNA文庫(kù)。問(wèn): (1)假定載體長(zhǎng)為43kb，cDNA的平均長(zhǎng)度是lkb，請(qǐng)估計(jì)在連接混合物中，載體分子同cDNA的比例是多少? (2)在此過(guò)程中，載體分子轉(zhuǎn)變成重組體的頻率是多少(每對(duì)核苷酸的平均分子量是 660Da)? (3)說(shuō)明怎樣處理載體和cDNA分子，才能把它們連接到一起。處

11、理過(guò)的載體本身能自連嗎?cDNA呢? (4)載體和cDNA分子要經(jīng)過(guò)怎樣的處理才能提高產(chǎn)生重組DNA分子的效率? (5)能夠用XhoI從重組質(zhì)粒中切出cDNA嗎?48、如何以大腸桿菌質(zhì)粒DNA為載體克隆一個(gè)編碼動(dòng)物激素的基因，并使之在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)?簡(jiǎn)要說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問(wèn)題及可能的解決方法。49、一個(gè)人類疾病基因被定位在7號(hào)染色體一段140kb的區(qū)域內(nèi)，并已別離到此染色體區(qū)段的克隆，但是并不知道該基因定位在此區(qū)域的哪一位置?？捎檬裁捶椒ㄕ业皆摶?50、種子在儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)生了某種變化，使得長(zhǎng)成的水稻很容易被一種病原菌感染。據(jù)推測(cè)可能是某一化學(xué)誘導(dǎo)的突變導(dǎo)致一個(gè)具有抗菌功能的關(guān)鍵酶喪失。

12、請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這種推測(cè)是否正確，如何使種子重新獲得對(duì)這種病的抗性? 51、從E.coli中別離到一種hemA突變體，這種突變是不可恢復(fù)的，并且需要生長(zhǎng)在琥珀酸的平板上才能利用6氨基乙酰丙酸合成血紅素。希望利用該突變體去克隆E.coli 的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均為2kb，然后將這些片段從BamH I位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒pBR322中，連接后轉(zhuǎn)化hemA突變體.根據(jù)氨芐青霉素抗性來(lái)選擇重組體。將篩選到的氨芐青霉素抗性克隆重植在加有氨基乙酰丙酸的平板上進(jìn)行測(cè)試。請(qǐng)問(wèn)：已經(jīng)測(cè)試的Ampr抗性轉(zhuǎn)化子中有多少不再需要在培養(yǎng)基中添加琥珀酸? (E.co

13、li基因組的全長(zhǎng)為4500kb)52、在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子?53、你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案，下面一步驟是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。為了節(jié)省時(shí)間，你略過(guò)了這一步，直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。錯(cuò)在哪里?54、為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個(gè)序列已知、編碼單體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物? 55、假定你別離到一個(gè)E.c

14、oli的Thy突變體，并推測(cè)有可能是Thy A基因突變。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案用PCR從染色體DNA擴(kuò)增突變的Thy A基因，測(cè)定突變的序列。(注：E.coli野生型的Thy A基因的序列是已知的)56、PCR反應(yīng)同大腸桿菌體內(nèi)的DNA復(fù)制有哪些不同?你認(rèn)為根本的差異在哪里？57、在古生物學(xué)中，尚不知道恐龍是否是溫血爬行動(dòng)物，而不像今天的變溫爬行動(dòng)物。 假設(shè)你得到一些恐龍的DNA，你如何通過(guò)PCR和基因克隆來(lái)檢測(cè)恐龍是否是溫血爬行動(dòng)物?58、你打算擴(kuò)增下列圖所示的兩段序列之間的DNA，請(qǐng)從所列出的引物中選出合適的一對(duì)？5GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG3 3CTGGACACCTTCG

15、GTATGCCCTAAC 5 引物1 引物2 5GACCTGTGGAAGC 5 CATACGGGATTG 5CTGGACACCTTCG 5GTATGCCCTAAC 5CGAAGGTGTCCAG 5 GTTAGGGCATAC5GCTTCCACCGGTC 5CAATCCCGTATG59、假定你從黏質(zhì)沙雷氏菌中克隆了一個(gè)基因，并推測(cè)可能是依賴于鋅的金屬蛋白酶，因?yàn)樗袃蓚€(gè)組氨酸和一個(gè)谷氨酸與鋅形成鋅指結(jié)構(gòu)。請(qǐng)你設(shè)計(jì)一個(gè)方案，改變其中一個(gè)組氨酸看看是否改變蛋白酶的活性?60、你打算將一個(gè)具有末端的DNA片段克隆到具有BamH I 末端的載體中。問(wèn)題是BamH I和Kpn I的末端是不匹配的，BamH

16、 I 是5突出端，Kpn I則是突出的3 端(圖)。一位朋友建議用下列圖所示的寡聚核苷酸“片段”來(lái)進(jìn)行連接。你并沒(méi)有馬上意識(shí)到達(dá)種方法是可行，因?yàn)槟阆氲降倪B接作用需要鄰近的5磷酸和3羥基。雖然寡聚核苷酸分子被限制性內(nèi)切核酸酶切割后會(huì)產(chǎn)生合適的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羥基。另外，雖然下列圖中接頭是及BamH I Kpn I ，但另一個(gè)接頭卻是Kpn IBamH I，你疑心相同的寡聚核苷酸是否能夠適合這兩種方式的連接。 (1)畫(huà)出Kpn IBamH I結(jié)合體和所需要的寡聚核苷酸片段的圖，這種寡聚核苷酸與下列圖所示的是否相同? (2)畫(huà)出用連接酶處理過(guò)的分子圖，指明被連接的缺口。(3)

17、你朋友的圖解方法有效嗎? 61、一個(gè)癌基因，從序列上看似乎編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)放在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該基因的產(chǎn)物是完全不溶的，這阻礙了對(duì)其功能的直接檢測(cè)，免疫染色說(shuō)明，這種蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，如同推測(cè)的一樣，是一種轉(zhuǎn)錄因子。如果能夠測(cè)出它所結(jié)合的DNA序列，就可以通過(guò)現(xiàn)有的序列資料中查找已知基因啟動(dòng)子的天然位點(diǎn)，從而能夠找到它所調(diào)節(jié)的基因。有人建議用PCR擴(kuò)增同該蛋白結(jié)合的微量DNA，思路(下列圖)是：(1)合成一組長(zhǎng)為26個(gè)堿基的隨機(jī)序列的寡聚核苷酸混合體，在該序列的兩側(cè)各有一段25個(gè)堿基的序列作為PCR擴(kuò)增的引物位點(diǎn)(圖A)；(2)把這些寡聚核苷酸加到含有轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞粗提取物中，轉(zhuǎn)錄因子可以同含有結(jié)合位點(diǎn)的寡聚核苷酸結(jié)合；(3)用轉(zhuǎn)錄因子特異的抗體別離同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的寡聚核苷酸；(4)用PCR擴(kuò)增選擇到的寡聚核苷酸進(jìn)行序列分析。按照這一思路，用0.2ng單鏈隨機(jī)序列的寡聚核苷酸開(kāi)始了這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這個(gè)寡聚核苷酸可以同一個(gè)PCR引物結(jié)合成部分雙鏈，經(jīng)過(guò)如圖B