小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào) 姓名 學(xué)院 專業(yè)、班級(jí) 實(shí)驗(yàn)課程名稱： 教師及職稱 開課學(xué)期 至 學(xué)年 學(xué)期 填報(bào)時(shí)間 年 月 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印一 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)時(shí)間實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法。2、 觀察小鼠染色體的形態(tài)特征,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的染色體數(shù)目。 3、了解微核發(fā)生的機(jī)制； 4、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義； 5、掌握對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物處理的一般程序； 6、掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般程序和規(guī)則，并鍛煉實(shí)踐能力。 二、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖1、骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象血淋巴細(xì)胞或組織那樣要經(jīng)

2、過體外培養(yǎng)。經(jīng)秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于紡綞體的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩極而使之停留于中期，同時(shí)染色體縮短，輪廓清晰，把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定處理，使細(xì)胞處于膨脹狀態(tài)，再將細(xì)胞懸液滴在載片上，使細(xì)胞破裂，染色體散開，染色后即可觀察到染色體。2、微核（Micronucleus）：染色單體或染色體的無著絲點(diǎn)斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物，都可用微核試驗(yàn)來檢測。各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微

3、核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，姬姆薩染色呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失，被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，微核容易辨認(rèn)，而且微核自發(fā)率低，因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。三、 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料1、材料：小白鼠（2n=40）2、器具：注射器（1ml，5ml各一支）、托盤、解剖剪、鑷子、吸管、離心管、離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。3、藥品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%檸檬酸三鈉，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，臨用時(shí)現(xiàn)配）

4、，Giemsa染液，2.2%檸檬酸鈉，0.01M磷酸緩沖液（PBS）pH6.8。4、生物顯微鏡、解剖剪、鑷子、注射器、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。四、 實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)一、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與觀察1、 處理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射處理小鼠（注射量為0.1ml/10g體重）。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g體重注射0.1ml。注射后24小時(shí)，可以取骨2、 處死：斷頸法處死小鼠。剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面，將吸有2.2%檸檬酸三鈉溶液的小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞，

5、反復(fù)吹打直至股骨呈白色，制成細(xì)胞懸液。3、低滲：將細(xì)胞懸液在1000rpm/min離心5min，棄除上清液，留0.5ml搖勻。向細(xì)胞液中再加入1%的檸檬酸三鈉溶液 5ml 用吸管輕吹打均勻，在室溫低滲 30min。低滲期間，配制固定液，即甲醇：冰醋酸為3:1（v/v)，置4 冰箱中備用。4.預(yù)固定(1次)：低滲處理后的細(xì)胞懸液離心5分鐘，留1ml原液，搖勻。加入新配制的固定液至6ml，吹打均勻，固定5分鐘，再在1000rpm/min離心3-5min，去掉上清液。5、固定（2次）：沿離心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml，用吸管輕輕吹打均勻，室溫下固定5min，1000rpm/min 3min，棄

6、去上清；如此反復(fù)固定兩次（共固定3次）。6.根據(jù)管底細(xì)胞量的多少，加入新配制的固定液0.3 0.8ml，用吸管打均勻，使其形成細(xì)胞懸液。7.滴片：將預(yù)冷的載玻片（0冰?。?，水平或傾斜45 角放置，用吸管吸取細(xì)胞懸液，從約0.5 -1m高處滴 12滴到片子上，用口將其吹干，靜置使其干燥。8.染色：將干燥的玻片放入2ml吉姆薩原液加入40ml磷酸緩沖液（pH6.8）配成的染液中染色20min，用磷酸緩沖液（pH6.8）沖洗，晾干后鏡檢。二、微核試驗(yàn)方法：1、骨髓的制取：斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面

7、，將吸有0.85% Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打使其混合均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄除上清液。2、涂片：在離心管中加入少量的小牛血清（約0.3ml)混勻后，按血常規(guī)涂片法涂片，長度約2cm 3cm (涂片時(shí)一次涂成）。在空氣中晾干。3、固定：將干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使當(dāng)日不染色，也應(yīng)固定后保存。4、染色：將固定過的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色20min 30min，然后立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。5、封片：用濾紙及時(shí)擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在

8、空氣中晃動(dòng)數(shù)次，以促其盡快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上適量光學(xué)樹脂膠，蓋上蓋玻片，寫好標(biāo)簽。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。數(shù)據(jù)處理：利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS的單因素方差分析或 t 檢驗(yàn)等方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如后表）。五、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總表1：受試物劑量mg/Kg組別各受試小鼠1000個(gè)受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)12345678對苯二酚1201383335373435363080228313032292833274032025212328262422秋水仙素3136333234353131371.

9、522925232624272524132421232019252219氯化汞312225202621232218221622211920181715131317151614151713陰性對照蒸餾水32143539陽性對照環(huán)磷酰胺40mg/kg體重3844454036414339表2 對苯二酚對動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率 組 別 劑量 動(dòng)物數(shù) 受檢細(xì)胞數(shù) 含微核細(xì)胞數(shù) 微核率 P值 (g/kg體重) (只) (個(gè)) (個(gè)) ()受試物12088000對苯二酚80880004088000 溶劑對照（蒸餾水）88000 陽性物對照 環(huán)磷酰胺 (mg/kg體重) 406參考文獻(xiàn)1孟紫強(qiáng)，阮愛東，桑楠等.SO2污染對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的誘發(fā)作用.環(huán)境科學(xué)，2002，23（4）123-125. 2孟紫強(qiáng)，桑楠，張波等.二氧化硫體內(nèi)衍生物誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng).環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20（2）239-243. 3耿德貴，王秀琴，劉士旺等.除草劑使它隆對黃鱔細(xì)胞的致突變作用研究.環(huán)境與健康雜志，2000，17（2）103-105.4周曉蓉，李百祥，邱向紅等.小鼠骨