多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ATF是哺乳動(dòng)物線粒體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子

1、基本信息題目：Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals期刊： Biol.影響因子：主要技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白質(zhì)組，代謝組及聯(lián)合分析研究背景線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變涉及人類100多種疾病,如退行性疾病、唐氏綜合癥、糖尿病、心臟病、衰老和癌癥等。線粒體是控制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。這些都與線粒體基因組、轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組表達(dá)譜有著密切的聯(lián)系。由于線粒體在能量生產(chǎn)、信號(hào)傳遞和新陳代謝等方面的重要作用，可以預(yù)測(cè)線粒體內(nèi)存在值得期待的蛋白質(zhì)?；?/p>

2、因表達(dá)不僅僅是從轉(zhuǎn)錄組到蛋白質(zhì)組的單向流動(dòng)，而是兩者的相互連接。要了解轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的相互調(diào)控作用，需要對(duì)RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行同步監(jiān)測(cè)。通過(guò)分析四種線粒體應(yīng)激處理后細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組的變化，發(fā)現(xiàn)ATF4基因是線粒體應(yīng)激調(diào)控的關(guān)鍵基因。研究?jī)?nèi)容及結(jié)果1. 線粒體應(yīng)激處理后有效改變線粒體功能作者分別用四種物質(zhì)（doxycycline四環(huán)霉素、actinonin放線酰胺素，F(xiàn)CCP碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙和MB（MitoBloCK）對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位能力出現(xiàn)不同程度的改變，其中以FCCP的應(yīng)激效果最好（），且除了doxycycline四環(huán)霉素處理外，其余處

3、理都有效提高了線粒體的活性氧自由基（Figure .1C和D）。圖1. 四種不同應(yīng)激條件OCR表達(dá)值2. 不同線粒體應(yīng)激處理后轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組變化作者分別用四種物質(zhì)（doxycycline四環(huán)霉素、actinonin放線酰胺素, FCCP碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙,和MB）對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行處理，時(shí)間24h，后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析（TMT）及高通量非靶向代謝組檢測(cè)技術(shù)（Figure 2A）。從轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)的分析結(jié)果來(lái)看，共鑒定出15174 轉(zhuǎn)錄本及8067個(gè)蛋白質(zhì)，其中線粒體中的差異基因及蛋白分別占到1053及878個(gè)，占比分別為6.9%及10.8%。通過(guò)聚類分析結(jié)果顯示，

4、與actinonin放線酰胺素, FCCP碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙及MB誘導(dǎo)結(jié)果相比， doxycycline誘導(dǎo)效應(yīng)相對(duì)較弱，不是很顯著（Figure 2C 和D）。在FDR的參數(shù)設(shè)置下，對(duì)不同誘導(dǎo)條件下的差異表達(dá)基因及蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析鑒定（Figure 2E）。結(jié)果顯示，actinonin放線酰胺素和MB誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)錄組水平的誘導(dǎo)響應(yīng)較為顯著，而在doxycycline四環(huán)霉素及FCCP碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙的誘導(dǎo)下的Hela細(xì)胞，其蛋白質(zhì)組水平誘導(dǎo)較為顯著。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，在所有的誘導(dǎo)條件下，線粒體水平上的差異變化，蛋白質(zhì)組層面比轉(zhuǎn)錄組層面的變化較為顯著，其線粒體差異基因表達(dá)量百分

5、比約為其他基因的3倍左右（Figure 2E）。有效的證明了不同應(yīng)激處理?xiàng)l件下線粒體在轉(zhuǎn)錄組層面及蛋白質(zhì)組層面發(fā)生了有效的變化。圖2. 不同應(yīng)激處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組層面變化3. 不同線粒體應(yīng)激處理導(dǎo)致氨基酸代謝途徑及生物合成途徑發(fā)生變化作者通過(guò)對(duì)上調(diào)的基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)59個(gè)基因上調(diào)，只有17個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)（Figure.3A ），上調(diào)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄組水平，并且集中在線粒體基因的上上調(diào)數(shù)為4個(gè)genes，2個(gè)蛋白質(zhì)，說(shuō)明了壓力誘導(dǎo)產(chǎn)生的表達(dá)量變化不集中在線粒體層面上。作者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組的KEGG富集分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，主要集中與氨基酸代謝途徑（Fig.3B），尤其是絲氨酸代謝

6、途徑相關(guān)的生物合成過(guò)程，并發(fā)現(xiàn)色氨酸合成過(guò)程上調(diào)的關(guān)鍵酶主要是PSAT1、PSPH及PHGDH以及SDSL。圖3. 不同應(yīng)激處理?xiàng)l件下代謝組層面鑒定色氨酸合成途徑關(guān)鍵酶4.不同線粒體應(yīng)激處理改變細(xì)胞代謝產(chǎn)物作者通過(guò)代謝組方法，研究4種不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞代謝產(chǎn)物的變化。代謝組數(shù)據(jù)鑒定到約300個(gè)有注釋的代謝物質(zhì)，通過(guò)聚類分析及熱圖的分析結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組整體上趨勢(shì)保持一致。其中doxycycline四環(huán)霉素處理組產(chǎn)生的影響效果更加顯著。通過(guò)差異表達(dá)分析及富集分析顯示：不同應(yīng)激處理后響應(yīng)效果最明顯的為甘油磷脂及鞘磷脂代謝途徑（B），并發(fā)現(xiàn)四種應(yīng)激處理后明顯上調(diào)或下調(diào)的代謝產(chǎn)物

7、基本保持一致，包括ceramide神經(jīng)酰胺，CDP-ethanolamine乙醇胺，及幾種溶血磷脂酰膽堿lysophosphatidycholine、lysophosphatidylethanolamine(Fig. 4D)。這些代謝產(chǎn)物的變化充分說(shuō)明了絲氨酸代謝增加通過(guò)神經(jīng)酰胺的效應(yīng)有效促進(jìn)了油脂及磷脂質(zhì)的生物合成。圖4. 不同處理?xiàng)l件下油脂及磷脂變化5. ATF4基因與不同應(yīng)激處理協(xié)同變化為了推測(cè)應(yīng)激處理響應(yīng)變化關(guān)鍵因素，作者采用HOMER分析方法對(duì)共同存在的上調(diào)基因進(jìn)行Denovo motif分析，并得到高分motif，序列為5-TTG CAT GACG-3，其在靶基因中存在比例為17.

8、65%，與ATF4、DDIT3/CHOP及CEBPB序列相似，其中ATF4得分率最高，極有可能是對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子（Figure.5B）并經(jīng)免疫共沉淀方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證的還有CHOP。作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)約一半的由應(yīng)激處理響應(yīng)的基因同樣是ATF4轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的靶基因（Figure.5C）。為進(jìn)一步驗(yàn)證，作者采用CRISP-Cas9敲除技術(shù)，獲得ATF4缺失Hela細(xì)胞后，對(duì)其進(jìn)行應(yīng)激處理，發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)ASNA,CHAC1,PCK2,PSHP靶基因?qū)?yīng)的缺失，并增強(qiáng)了ATP呼吸依賴性，說(shuō)明其在線粒體功能調(diào)控上起重要作用。圖5. 不同處理?xiàng)l件下ATF4基因協(xié)同變化6. 比較分析人及模型鼠群中ATF4途徑

9、及線粒體脅迫間的遺傳效應(yīng)作者通過(guò)GTEx小鼠居群數(shù)據(jù)進(jìn)行mt-stress基因表達(dá)研究，并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)分析圖，并對(duì)ATF4,DDIT3/CHOP和CEBPB轉(zhuǎn)錄因子做關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示mt-stress基因與BXD數(shù)據(jù)聚類關(guān)系較近，通過(guò)系列的驗(yàn)證最終證明ATF4通過(guò)ISR激活效應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝及線粒體功能，進(jìn)而對(duì)外界脅迫刺激進(jìn)行響應(yīng)適應(yīng)。圖6. 小鼠模型Mt-stress基因表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建文章小結(jié)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組，蛋白質(zhì)組及代謝組技術(shù)的單獨(dú)測(cè)序及關(guān)聯(lián)分析，對(duì)Hela細(xì)胞在四種試劑誘導(dǎo)下的樣品進(jìn)行線粒體功能脅迫方面的分析比較，初步探討了線粒體應(yīng)激脅迫響應(yīng)途徑參與的相關(guān)基因，并發(fā)現(xiàn)ATF4是響應(yīng)的關(guān)鍵因子

10、，并通過(guò)在人及動(dòng)物鼠模型中進(jìn)一步的驗(yàn)證比較尋求其調(diào)控機(jī)制，ATF4通過(guò)降低MRPs的表達(dá)水平，從而達(dá)到減弱轉(zhuǎn)錄能力的效果，從而有效適應(yīng)外界脅迫條件，為研究線粒體功能障礙等相關(guān)疾病的研究探索提供了理論依據(jù)。解析文獻(xiàn)Quirós P M, Prado M A, Zamboni N, et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammalsJ. Journal of Cell Biology, 2017, 216(7):2027

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