小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子VIGS基因沉默載體構(gòu)建及驗證

1、小麥 WRK 轉(zhuǎn)錄因子 VIGS 基因沉默載體構(gòu)建及驗證： WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance ， which widely exist in various plants. After TaWRKYgene was silenced by VIGS method， it wasfound that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and thepercentage of abnormal appressoria

2、 declined， such as papilla. Theresults indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.小麥白粉病是由布氏白粉菌 ( Blumeria graminis f. sp. Tritici ) 侵染 所引起的真菌感染性病害，如遇高溫多濕天氣病 害流行，會使小麥嚴重 受害，導致減產(chǎn)13%- 34%1 。因此，科學家一方面通過抗病育種， 不斷培育新的抗病小麥品種來抵御 病害， 另一方面通過深入的抗病分子機理研究， 克隆抗病相關基 因、弄清抗病 信號通路以及基因

3、工程等技術手段， 以到達抗病分 子育種的目的。轉(zhuǎn)錄因子可以與真核基因啟動子區(qū)中的順式作用元件互作， 激活或 抑制多個下游功能基因轉(zhuǎn)錄， 從而使植株獲得綜合改進效 果。研究說明， WRK 轉(zhuǎn)錄因子家族幾乎存在于所有植物中， 它 們共同含有一段高度保守 氨基酸序列 WRKYGQK2 WRK 廣泛參 與植物種子萌發(fā)與休眠、開花、代謝、激素信號轉(zhuǎn)導，還參與抵御生物和非生物脅迫等反響過程。擬南芥AtWRK Y3 基因直接調(diào)控了植物抗毒素 Camalexin 的合成 3 ，并且調(diào)控大量抗病相關 基因的 表達4 。大豆中 GmWRKY5B GmWRKY7 6過表達會造成 作物提早開花， 表達量的區(qū)別對花形態(tài)

4、造成不同影響 5 。水稻 中 OsWRKY 基因的過 表達有助于提高作物對病原菌的抗性，同時可直接調(diào)控異分支酸合成酶的表達從而增加水楊酸的濃度實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)6 。小麥 ( Triticum aestivum ) TaWRKY9 可調(diào)節(jié)作 物對滲透壓、高鹽、 干旱和低溫等脅迫的耐性 7 。迄今為止， 研究人員已經(jīng)在大麥 B 、 擬南芥 9 、大豆 10 和水稻 11 等多 種植物中都鑒定到不同數(shù)量的 WRK 轉(zhuǎn)錄因子。病毒誘導基因沉默 ( VIGS-induced gene silencing ， VIGS) 是引 起內(nèi)源 mRNA 特異性降解、引起基因轉(zhuǎn)錄沉默的技術。 VIGS 試驗周期短，操作

5、簡便，并且無需轉(zhuǎn)化。近年來，在植物基因功 能研究 中， VIGS 技術作為一種簡單、快速、高效的反向遺傳學 技術在禾本科 植物基因功能研究中發(fā)揮了重要作用 12-13 。本研究以前期工作獲得的 TaWRK 基因為根底 14 ，利用 VIGS 技 術獲得沉默植株，通過對基因沉默前后白粉菌侵染情況 進行觀察統(tǒng)計， 最終確定 TaWRK 基因在小麥抗白粉病過程中的 功能。1 材料和方法1.1 試驗材料與試劑 抗白粉病品種 Brock ，由 Ray Johnson 博士惠贈。小麥白粉菌 15 號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研 究所提供。1.2 沉默 TaWRK 的 VIGS 載體構(gòu)建在目的基因核

6、苷酸序列的非保守區(qū)， 設計上、 下游特異性沉 默引 物 TaWRKY-VIGS- 和 TaWRKY-VIGS- , 以抗病小麥 Brock 總 RNA 合成 的 cDNA 為模版，擴增富集沉默片段，將該片段與BSMY : 連接構(gòu)建重組載體 BSMY : TaWRK ，構(gòu)建過程參見 Li 等15。1.3 基因沉默效率檢測 通過限制性內(nèi)切酶酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄后， 獲得病毒 RNA組分通過摩擦接種方法接種到小麥第 2 葉上，待接 ？NH2O 對照 1、BSMV GFP 對照 2和 BSMV TaWRKY 組小麥第 3 葉伸展 完全， 采用抖拂法對各株植株第 3 葉均勻高密度接種新鮮白粉菌 抱子，在

7、相應 時間點取葉片，利用半定量 PCR 方法檢測這 3 組植 株中 TaWRK 基因 的 mRN 冰平的水平變化，從而確定 TaWRK 基 因沉默的效率。1.4 基因沉默后對小麥抗白粉病表型的影響取接種 48，72 h 和 7 d 后的小麥葉片，用考馬斯亮藍染色 方法染 色并觀察統(tǒng)計白粉菌抱子的生長發(fā)育情況， 通過與對照白 粉菌抱子萌發(fā)、 畸形胞比例等的比照分析， 確定目標基因在抗白 粉病過程中的奉獻。2 結(jié)果與分析2.1 VIGS 沉默載體構(gòu)建根據(jù)已獲得 TaWRK 基因序列，在基因的非保守區(qū)設計添加 了 NheI 識別序列的引物 WR KY -V-F ( AGCCGCAGCAGCAG )A

8、A 、CGWRKY-V- CTTGAAGCTGGGGTC CT 以含 TaWRK 基因序列的重 組 質(zhì)粒作為模板，擴增用于構(gòu)建 BSMV t 組載體的目的基因片段， 擴增結(jié) 果如圖 1 所示。目的片段大小約為 250 bp 左右，隨后將 回收后的目的 片段進行酶切形成粘性末端， BSMX 載體同樣經(jīng)過 酶切回收，與目的片段進行連接，通過進一步篩選、驗證，挑選陽性克隆送測驗證。2.2 VIGS 技術沉默靶基因后 TaWRKY表達水平檢測在 TaWRK 基因的特異性核苷酸序列區(qū)段設計引物，擴增一 個長 227 bp 的片段構(gòu)建 TaWRK 基因沉默載體 BSMY : TaWRKY 本次 沉默試驗共

9、設置 4 個組別，分別為 H20 對照組空白對照 、BSMV GFP 對照組陽性對照、 BSMV PDS 對照組沉默 PDS 基因、 BSMV TaWRKY 式驗組沉默目的基因 TaWRK 。為了 驗證本試驗所建立的 沉默體系成功有效， 分別對各組摩擦接種后 約 15 d 的小麥第 3 葉進行 表型觀察， 結(jié)果如圖 2 所示。除 BSMV : PDS 對照組葉片發(fā)生明顯白 化現(xiàn)象之外，其他組葉片均呈綠色， 說明該基因沉默體系構(gòu)建成功。2.3 TaWRKY 基因沉默效率驗證為了進一步證實 TaWRK 基因是否被有效沉默，采用半定量PCR 的方法，對沉默后各組植株中 TaWRK 基因的轉(zhuǎn)錄水平進行

10、 了檢測， 結(jié)果如圖 3 所示。從圖中可以看出， 摩擦接種后， TaWRKY 試驗組的 mRNA 水平明顯低于 H20 和 GFP 對照組，說明小麥內(nèi)源TaWRK 基因被有效沉默了。另外，在接種重組病毒BSMV GFP后， TaWRK 基因的表達也有輕微下調(diào)，該現(xiàn)象可能是由于病毒 的侵染 對植株造成了影響。2.4 TaWRKY 基因沉默植株抗病分析為了進一步研究 TaWRK 基因在小麥葉片與白粉菌的互作過 程中所 起到的調(diào)控作用， 本研究使用考馬斯亮藍染色法分別對接種 48，72 h和 7 d 后的 GFP 組、 TaWRK 組小麥植株的第 3 葉進 行固定、染色、制 片，在顯微鏡下進行鏡檢，

11、觀察各時間點中， 白粉菌萌發(fā)形態(tài)及生長狀 態(tài)，如圖 4 所示。從圖 4 中可以看出： 染菌 48 h 后， TaWRK 組白粉 菌抱子萌發(fā)狀態(tài)優(yōu)于對照組， 抱子 萌發(fā)，芽管伸長，形成附著胞； 染菌 72 h 后， TaWRK 試驗組白 粉菌抱子大量萌發(fā)形成次生菌絲， 而各對照組 中， 抱子萌發(fā)出現(xiàn) 分瓣型畸形附著胞、纖細型畸形附著胞等；染菌7 d后， TaWRKY 試驗組白粉菌抱子大量生成串珠狀分生抱子， 而各對照 組中， 僅 有少量抱子萌發(fā)形成次生菌絲。在鏡檢觀察抱子發(fā)育結(jié)構(gòu)的同時， 統(tǒng)計各個視野內(nèi)白粉菌抱 子萌 發(fā)率、畸形率、寄主抗性等參數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果如圖 5、圖 6 所 示。由圖可 以得出

12、，接種白粉菌 48 h 后，白粉菌對 TaWRK 基因 沉默后的植株侵 染成功率增加， 畸形附著胞比例下降，與 GFP 對 照組相比， TaWRK 基因沉默組植株白粉菌抱子萌發(fā)率上升，畸 形附著 胞分瓣型附著胞、纖細型附著胞等比例下降。3 結(jié)論與討論自 1994 年 , shiguro 和 Nakamura16 首次 ？ 母適恚 ？lpomoea batatas 中克隆出第一個 WRK 蛋白 SPF1, 研究人員對于植物 WRK 轉(zhuǎn) 錄因子家族開展了大量研究。越來越多的研究結(jié)果說明， WRKY 蛋白在 植物生長發(fā)育，抵御生物以及非生物脅迫等多種生 理生化過程中發(fā)揮重 要作用 17 。前期工作中

13、，筆者在小麥 Brock 中別離到一個 WRKY 類 轉(zhuǎn)錄因子基因 TaWRKY 并初步證實該基因 參與了小麥的白粉菌脅迫應 答反響，但還不能夠較確切了解 TaWRK 基因與小麥抗白粉病之間的關 系12 。關于病毒介導的基因沉默技術已經(jīng)廣泛地應用于基因功能 研究 18-21 ，但該方法由于涉及到病毒感染，從而影響對正確 結(jié)果的判斷而 備受爭議。 本研究為了降低這種系統(tǒng)誤差， 采取了 3 個對照組，即用 GKP 緩沖液作為摩擦接種介質(zhì)為陰性對照，用 綠色熒光蛋白基因構(gòu)建 Y 載體BSMY : GFP編碼葉綠素關鍵 酶基因PDS基因構(gòu)建丫載體BSMY : PDS 為兩個陽性對照組。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： GKP 緩沖液和 GFP 對照組生長正 常