檢測(cè)磷酸化蛋白和總蛋白的機(jī)理和實(shí)驗(yàn)技巧總結(jié),研究人員轉(zhuǎn)發(fā)

1、檢測(cè)磷酸化蛋白和總蛋白的機(jī)理和實(shí)驗(yàn)技巧總結(jié)，研究人員轉(zhuǎn)發(fā)檢測(cè)磷酸化蛋白的抗體是針對(duì)該蛋白的特異性磷酸化位點(diǎn)的，而檢測(cè)總蛋白的抗體一般針對(duì)的是該蛋白別的位點(diǎn)，故而磷酸化抗體檢測(cè)不到總蛋白，而總蛋白抗體能檢測(cè)包括磷酸化和未磷酸化蛋白在內(nèi)的目的蛋白。磷酸化蛋白的Western Blotting檢測(cè)是信號(hào)通路研究中的經(jīng)典方法。本文根據(jù)丁香通llllcjchina站友的【做磷酸化蛋白的western blot之我見(jiàn)】一文詳細(xì)總結(jié)了操作過(guò)程中的注意的事項(xiàng)，供剛?cè)腴T的同仁們參考：1. 一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信

2、。附：lysis buffer配方Buffer Company Cat.No.Stock Working 100mlMWg/100mlmlTris1.080382.2500(Merck) 121.14 1M 12.114 5NaCl 31434(Riedel-deHaen) 58.44 5M 29.22 3NP-40 I-3021(Sigma)10% 1010 Sodium deoxycholate D6750(Sigma) 414.6 10% 10 2.5EGTA.4Na E8145(Sigma) 468.3 0.25M 11.70750.4Protease inhibitors Aprot

3、enin A6279(Sigma) 10mg/ml 0.1Leupeptin 10mg/ml 0.1PMSF 100mM 1Phosphatase inhibitors b-glycerophosphate1M 1Na3VO4S6508(Sigma)183.9200mM3.680.5NaF1.06449(Merck)41.990.5M2.09950.2H2O 78.2說(shuō)明：(1) Na3VO4要活化：Activation ofSodium Ortho Vanadatea. Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O。用ddH2O配制200mM濃度的原

4、礬酸鈉（3.68克原礬酸鈉加入100ml ddH2O中）b. Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pHvaries depending on the lot of the chemical)。At pH 10.0the solution is yellow。以1M NaOH 或1M HCl調(diào)整pH值至10.0，此時(shí)溶液呈黃色。c. Boil the solution until it turnscolorless (about 10 mins)。煮沸直至溶液變?yōu)闊o(wú)色。d. Allow solution to cool t

5、o roomtemperature。冷卻至室溫。e.Readjust pH to 10.0 and repeat steps c & duntil the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store inaliquots at -20°C。重調(diào)pH值至10.0，重復(fù)c、d兩步，直到變?yōu)闊o(wú)色且pH值穩(wěn)定至10.0，分裝保存在-20°C。NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, convertingit to a more potent

6、inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J.Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.(2) 我的配方配的是100ml 細(xì)胞裂解液，但如您各個(gè)成分的體積加起來(lái)，會(huì)發(fā)現(xiàn)total=102.1ml，那是因?yàn)檫@些成分加在一起后總體積會(huì)縮小的。(3) lysis buffer的使用方法：a. 細(xì)胞用typsine消化下來(lái)后，PBS洗2次(1500rpm，離心5min)，然后加適量lysis buffer(1×107個(gè)細(xì)胞約用200ul，但建議根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整ul數(shù)，使后來(lái)測(cè)定的蛋白濃度在5

7、-10ug/ul左右，但不需要太精確)。冰浴30min(中間最好vortex一下)，然后12000rpm，4度，離心15min，取上清，然后進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)如測(cè)定蛋白濃度等。b. 保存在-80冰箱可以保證蛋白磷酸化的程度不受影響。提取蛋白時(shí)，組織要在液氮中研磨成粉狀（研缽也要先在低溫下保存，而且要保證研缽周圍不掛水珠，這才能真正保證低溫。），將粉末轉(zhuǎn)移到ependoff管中后加適量lysis buffer裂解，之后的處理跟細(xì)胞的類似。要特別注意，要讓組織保持低溫，以保證蛋白不會(huì)脫磷酸化。(4) 把抑制劑配成stock后，再把抑制劑全部加入到裂解液中混合，保存于-20度。一般配40-50ml，分裝成

8、10ml每管，所有試劑都加好的，用時(shí)取出，用完再放回-20度冰箱。我使用時(shí)沒(méi)有問(wèn)題，至少在冰箱中放了兩三個(gè)月。酶的抑制劑是不太穩(wěn)定，但我的配方中抑制劑是過(guò)量的，所以問(wèn)題不大。我不采用使用前再加抑制劑是因?yàn)楸苊馔浖右种苿蛘呒词辜恿艘种苿┮踩菀资箤?shí)驗(yàn)多一個(gè)步驟，容易造成混亂。2. 加一抗后最好4度過(guò)夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。4度也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時(shí)即可。3. 磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。個(gè)人認(rèn)為，Cell signaling公司做的磷酸化抗體不錯(cuò)，尤其是MAPKs磷酸化抗體。4

9、. 最好根據(jù)廠商的protocol來(lái)操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。如Cell signaling會(huì)建議用含5%BSA的TBST稀釋phospho-p38等抗體，效果不錯(cuò)，而不是用常見(jiàn)的含5%non-fat milk的TBST。5. 抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會(huì)有不同要求。6. 研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。這樣才有更強(qiáng)的說(shuō)服力，可以區(qū)分磷酸化水平的增加是因?yàn)榭偟牡鞍妆磉_(dá)增加，還是因?yàn)闆](méi)有改變總蛋白，只是磷酸化水平增加了。如壓完phospho-p38抗體后，我會(huì)把相同的membrane做strip后再壓p38,然后再strip一次，再壓內(nèi)標(biāo)actin。補(bǔ)充

10、：正如我上面所說(shuō)的，“研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量”。這有兩種方法，一是：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)gel，壓內(nèi)標(biāo)。但是本人不建議如此做，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較公認(rèn)的，本人也建議如此的方法，即：將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去（strip）。1）Strip Solution（Stripping Buffer，膜再生液）如下:常溫密閉保存（有臭雞蛋味道），能放很久，幾個(gè)月不成問(wèn)題。2）Strip

11、方法準(zhǔn)備一硬塑料盒，倒入strip solution，將膜完全浸泡（或者將膜與strip buffer封入塑料薄膜中，完全浸入水浴鍋中，使四周都能接觸恒溫水），50度水浴30min，用TBST洗5分鐘，3次即可去除已孵育結(jié)合的抗體。信號(hào)會(huì)均勻地減弱些許，但不會(huì)造成差異。許多人會(huì)建議55度水浴30min。Strip solution是用來(lái)去除已結(jié)合的抗體，但也會(huì)去除部分的蛋白，導(dǎo)致蛋白信號(hào)變?nèi)酢Ｎ冶救私?jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴時(shí)有時(shí)溫度不穩(wěn)定，溫度定為55度時(shí)往往其溫度容易超過(guò)，導(dǎo)致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設(shè)為50度30min，既能有效去除已結(jié)合的抗體，又比55度更能保護(hù)蛋白.3）另外一個(gè)Stripp

12、ingbuffer的配方：4）Strip時(shí)一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受熱均勻。這一點(diǎn)很重要，要不然，隨后壓出來(lái)的總蛋白也好，內(nèi)標(biāo)也好，就會(huì)不均一，無(wú)法進(jìn)行比較。我曾將同一張membrane用我提供的方法strip了3次，分別壓不同的抗體（因?yàn)橛袝r(shí)候蛋白分子量很接近），效果都不錯(cuò)。7. 做磷酸化蛋白WB時(shí)，除了目標(biāo)蛋白的band以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的band。磷酸化抗體不好的話，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘腷and，而沒(méi)有你想要的band，所以壓片以后，你一定要根據(jù)markers比對(duì)一下，你壓出的band分

13、子量是否正確。我以前壓WB時(shí)，壓出了一條band，就以為是我想要的那條，然后還根據(jù)趨勢(shì)推測(cè)可能的機(jī)制，走了不少冤枉路。還有一次，把markers的分子量記錯(cuò)了，比對(duì)出來(lái)的結(jié)果當(dāng)然也不對(duì)。8. 磷酸化蛋白WB時(shí)backgroud也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當(dāng)，不能太長(zhǎng)或過(guò)短，太長(zhǎng)則backgroud太深，蓋住想要的那條band，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有band或者band太淺。9. 磷酸化蛋白WB時(shí)，用TBST洗時(shí)也要注意一下，搖床的轉(zhuǎn)速不要太快，洗的時(shí)間不要太長(zhǎng)，孵育一抗和二抗之后分別洗5min 3次即可，寧愿background深一些，總比做不出來(lái)強(qiáng)得多。另外，洗的時(shí)候，最好不要把幾張membrane疊在一起洗。10. 磷酸化蛋白Western blot高背景的可能原因(1) 磷酸化蛋白抗體本身特性造成的，這一點(diǎn)除了換抗體，否則無(wú)法改善。(2) Nitrocellulose/PVDF膜質(zhì)量不高。(3) ECL熒光發(fā)光劑質(zhì)量不高。(4) 封閉時(shí)要用含5%non-fat milk的TBST，室溫1小時(shí)，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。(5) 加入一抗后要4過(guò)夜。而且一抗要用合適的buffer稀釋，一定要根據(jù)抗體公司的protocol建議之buffer稀釋。