植物基因功能研究策略

1、 目錄目錄基因功能研究的內容基因功能研究的內容基因功能研究的意義基因功能研究的意義基因功能研究的現(xiàn)狀基因功能研究的現(xiàn)狀基因功能研究策略基因功能研究策略 正向遺傳學策略正向遺傳學策略 反向遺傳學策略反向遺傳學策略What is gene?In Genetics the basic unit of heredity that is transmitted from parents to offspring in reproduction, which determines inherited traits.In Molecular Biology - entire nucleic acid seq

2、uence necessary for the synthesis of a functional polypeptide (protein chain) or functional RNA現(xiàn)代對基因的定義是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列總稱，是遺傳物質的最小功能單位。What is Gene expression?基因功能研究的內容基因功能研究的內容基因功能研究內容功能基因鑒定基因表達規(guī)律基因產物生化功能基因表達的生理功能植物基因功能研究的目標植物基因功能研究的目標 確定和理解決定植物生命活動的所有基因，從分子、生化和生理水平上揭示植物生命活動機理。這些知識最終將會提高人類駕馭

3、植物生產的能力。植物基因功能研究的重要意義植物基因功能研究的重要意義提高利用常規(guī)方法培育新品種的能力；提高利用基因工程手段改良植物品種的能力；采取更有針對性的栽培生產措施，提高生產效率；更有效的利用植物資源生產人類所需要的產品；提高對珍稀植物的保護能力。植物基因功能研究的植物基因功能研究的現(xiàn)狀現(xiàn)狀在擬南芥、水稻基因組和其它作物已完成測定的序列中，只有部分基因進行了功能研究。多數(shù)只通過ESTs和OFR等進行了鑒定。許多基因在植物生長發(fā)育中的確切功能和作用還不清楚?；驕y序的步伐遠大于基因功能研究的腳步，公共數(shù)據庫的DNA序列每天都以數(shù)萬核苷酸的速度增加。DNA序列的主要數(shù)據庫序列的主要數(shù)據庫ht

4、tp:// National Center for Biotechnology Information / MaizeGDB is funded by a cooperative agreement through the USDA Agricultural Research Service.植物基因功能研究的植物基因功能研究的現(xiàn)狀現(xiàn)狀DNA序列的主要數(shù)據庫序列的主要數(shù)據庫/ SGDTM（ Saccharomyces Genome Database）is a s

5、cientific database of the molecular Saccharomyces biology and genetics of the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is commonly known as bakers or budding yeast. 植物基因功能研究策略植物基因功能研究策略正向遺傳學策略正向遺傳學策略 forward genetics strategyforward genetics strategy反向遺傳學策略反向遺傳學策略 reverse genetics strategyreverse genet

6、ics strategy正向遺傳學正向遺傳學策略策略forward genetics strategyforward genetics strategy表現(xiàn)型表現(xiàn)型 基因型基因型Phenotype Genotype正向遺傳學正向遺傳學策略策略誘變誘變 突變體篩選突變體篩選 克隆基因克隆基因 基因功能基因功能技術路線技術路線正向遺傳學策略正向遺傳學策略基因突變基因突變基因失活或基因失活或產物無功能產物無功能recessive基因表達減弱基因表達減弱或產物活性或產物活性降低降低基因表達加強基因表達加強或產物具有或產物具有新功能新功能dominant正向遺傳學策略正向遺傳學策略誘變劑誘變劑 Muta

7、genesis化學誘變劑化學誘變劑 Chemical mutagens輻射輻射 RadiationTDNA和和 轉座子插入轉座子插入 TDNA or transposon insertion 誘誘 變變 基因突變的分子基礎按突變發(fā)生的原因分類按突變發(fā)生的原因分類 自發(fā)突變自發(fā)突變(spontaneous mutation):(spontaneous mutation):在自然狀況下在自然狀況下發(fā)生的突變。發(fā)生的突變。 誘發(fā)突變誘發(fā)突變(induced mutation):(induced mutation):有機體暴露在誘變有機體暴露在誘變劑中引起的突變。劑中引起的突變。一一. .自發(fā)突變的分

8、子基礎自發(fā)突變的分子基礎 自發(fā)突變可能由自發(fā)突變可能由DNADNA復制錯誤復制錯誤, ,自發(fā)損傷和轉座因子自發(fā)損傷和轉座因子等多種原因引起等多種原因引起。( (一一)DNA)DNA復制中的錯誤復制中的錯誤 遺傳物質是遺傳物質是DNA,DNADNA,DNA復制是半保留復制復制是半保留復制, ,如果發(fā)生錯如果發(fā)生錯誤誤, ,引起堿基替換引起堿基替換(base substitution), (base substitution), 即一對堿基即一對堿基被另一對堿基替換，造成被另一對堿基替換，造成DNADNA遺傳信息的改變。從而導遺傳信息的改變。從而導致基因突變致基因突變。 正常情況下正常情況下,A-

9、T配對配對,氨基態(tài)的腺嘌呤氨基態(tài)的腺嘌呤(A)只與胸腺嘧啶只與胸腺嘧啶(T)配對配對,但有時可轉變成稀有的亞氨基形式但有時可轉變成稀有的亞氨基形式,可以與胞嘧啶配對可以與胞嘧啶配對,形成形成A-C, 再再經一次復制經一次復制,DNA分子中的分子中的A-T對變成了對變成了G-C對對. 這種互變異構可以這種互變異構可以在在DNA復制中自發(fā)產生復制中自發(fā)產生。堿基替換可以分為轉換和顛換堿基替換可以分為轉換和顛換: : 1. 1.轉換轉換(transitions):(transitions):嘌呤替代嘌呤嘌呤替代嘌呤, ,或嘧啶替或嘧啶替代嘧啶代嘧啶。 A AG G或或G GA , TA , TC C

10、或或C CT T 2.2.顛換顛換(Tran versions):(Tran versions):嘌呤替代嘧啶嘌呤替代嘧啶, ,或嘧或嘧啶替代嘌呤啶替代嘌呤。 A AC, AC, AT , CT , CA, TA, TA A 3.3.移碼突變移碼突變（frame-shift mutationframe-shift mutation）: :在在DNADNA復制中發(fā)生增加或減少一個或幾個堿基對所造復制中發(fā)生增加或減少一個或幾個堿基對所造成的突變。移碼突變可造成蛋白質分子發(fā)生較大成的突變。移碼突變可造成蛋白質分子發(fā)生較大的結構改變的結構改變。 ( (二二) ) 自發(fā)損傷自發(fā)損傷(spontaneou

11、s lesions) (spontaneous lesions) 即自然產生的即自然產生的DNADNA損傷引起突變損傷引起突變, ,如脫嘌呤和脫氨如脫嘌呤和脫氨基等?；取?1.1.脫嘌呤脫嘌呤：最為常見，由于：最為常見，由于DNADNA分子中堿基和脫分子中堿基和脫氧核糖間的糖苷鍵受到破壞，從而引起一個鳥嘌呤氧核糖間的糖苷鍵受到破壞，從而引起一個鳥嘌呤(G)(G)或腺嘌呤或腺嘌呤(a)(a)從從DNADNA分子上脫落下來。造成分子上脫落下來。造成DNADNA損傷，損傷，產生無嘌呤位點，在產生無嘌呤位點，在DNADNA復制中引入錯誤；或由修復復制中引入錯誤；或由修復系統(tǒng)移去無嘌呤位點或插入一個堿

12、基而引起突變。系統(tǒng)移去無嘌呤位點或插入一個堿基而引起突變。 2.2.脫氨基脫氨基：胞嘧啶脫氨基變成：胞嘧啶脫氨基變成U,UU,U與與A A配對，結果配對，結果使使 G-CG-C對變成對變成 A-TA-T對（轉換對（轉換) )。 3.3.氧化性損傷氧化性損傷：個體自然產生的氧化基，氧化物：個體自然產生的氧化基，氧化物如超氧自由基如超氧自由基, ,氫氧自由基及過氧化基等，能對氫氧自由基及過氧化基等，能對DNADNA造造成氧化性損傷，引起突變，導致人類疾病成氧化性損傷，引起突變，導致人類疾病。 烯醇式結構玉米中控制分枝的tb1基因是一個轉錄因子，該基因上游41kb作為順式調控因子，調控tb1基因的表

13、達，玉米中tb1的表達量是大芻草中的2倍，該基因表達上的變化造成玉米和大芻草形態(tài)上的巨大差異。Nature, 1997, 386: 485-488玉米中tga1基因控制穎殼的有無，該性狀只有一個基因控制，由于tga1基因一個氨基酸的替換，造成玉米和大芻草如此巨大的表型差異。Nature, 2005, 436: 714-719水稻落?；蛟?006年的science上有兩篇文章，一篇是比較indica和野生稻sh4，是由于一個氨基酸的替換造成的，另一篇是日本人做的，比較indica和japonica的qSH1，此基因是由于調控區(qū)一個SNP引起的。 Science, 2006, 311: 1936

14、-1939小麥的Q基因具有多效性，影響到脫粒、小穗長度，株高和抽穗等一系列性狀。該基因也是一個轉錄因子。也是由于一個氨基酸的替換影響了同源二聚體的形成。Genetics, 2006, 172: 547-555小麥中的Gpc-B1基因，NAC類轉錄因子，在野生小麥中由于該基因的表達，籽粒蛋白含量、鋅和鐵含量較栽培小麥提高很大，而栽培小麥中，該基因由于一個堿基的插入造成移碼突變而失活，但卻使持綠性增強。Science, 2006, 314: 1298-1301擬南芥中控制種子大小的AP2基因突變體中在第一個AP2結構域有一個11bp的缺失，造成null mutation，結果種子增大，細胞數(shù)增大，

15、細胞體積增大。PNAS, 2005, 102: 3123-3128控制番茄果型大小的fw2.2是最早克隆的QTL，僅僅因為成熟晚期表達豐度的不同，造成野生型和栽培型果型大小的如此大的差別。Science, 2000, 289:85-88 二二 誘發(fā)突變的分子基礎誘發(fā)突變的分子基礎 各種誘變劑（物理或化學的）可誘發(fā)基因的突變。誘變劑可以取各種誘變劑（物理或化學的）可誘發(fā)基因的突變。誘變劑可以取代堿基，改變堿基或破壞堿基，使代堿基，改變堿基或破壞堿基，使DNADNA發(fā)生錯配，而引起基因突變。發(fā)生錯配，而引起基因突變。( (一一) )堿基類似物：與堿基結構類似，可替代正常堿基摻入堿基類似物：與堿基結

16、構類似，可替代正常堿基摻入DNADNA分子，分子，引起堿基替換。如引起堿基替換。如5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BUBU）是胸腺嘧啶）是胸腺嘧啶T T的類似物，可摻的類似物，可摻入入DNADNA分子中。分子中。BUBU有兩種互變異構體酮式和烯醇式。酮式與有兩種互變異構體酮式和烯醇式。酮式與A A配對，配對，而烯醇式與而烯醇式與G G配對，這樣很容易引起配對，這樣很容易引起G-CG-C對與對與A-TA-T對的互相轉換。除對的互相轉換。除BUBU外，外，5-5-溴脫氧尿苷（溴脫氧尿苷（BrdUBrdU），），5-5-尿嘧啶，尿嘧啶，5-5-氯尿嘧啶及其脫氧氯尿嘧啶及其脫氧核苷。核苷。2-2-氨基嘌呤

17、（氨基嘌呤（2-AP2-AP）等都是堿基類似物。）等都是堿基類似物。正向遺傳學策略正向遺傳學策略mispairingATABuGBuGCBumutation堿基類似物堿基類似物誘誘 變變 (二二)烷化劑：烷化劑：常用的烷化劑有硫酸二乙脂（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、異丙基甲烷磺酸酯（iPMS）、芥子氣類。另外，亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基乙基脲（NEH）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、乙烯亞胺（EI）、1,4-雙重氮乙酰丁烷，也是有效的誘變劑，但是有毒，應用危險，是潛在致癌物質( (三三) )嵌合劑：嵌合劑：吖啶類染料的分子為平面結構，大小與堿基對吖啶類染料的分子

18、為平面結構，大小與堿基對 差不多，可差不多，可插入插入DNADNA雙鏈核心堆積的堿基對之間，在嵌入的位置引起單雙鏈核心堆積的堿基對之間，在嵌入的位置引起單 個堿基對的插個堿基對的插入或缺失，造成移碼突變。如口丫啶橙，溴化已啶（入或缺失，造成移碼突變。如口丫啶橙，溴化已啶（EBEB），原黃素和黃素等。），原黃素和黃素等。( (四四) )紫外線（紫外線（UVUV）: :可使可使DNADNA產生很多光生成物，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體。產生很多光生成物，如環(huán)丁烷嘧啶二聚體。( (五五) )電離輻射：電離輻射：使使DNADNA分子發(fā)生氫鍵斷裂，分子發(fā)生氫鍵斷裂，DNADNA單鏈或雙鏈斷裂，堿基或單鏈或雙鏈斷裂

19、，堿基或糖基損傷，糖基損傷，DNADNA，蛋白質相互交聯(lián)等。，蛋白質相互交聯(lián)等。x x射線，射線，射線等，具有較高的能量可引射線等，具有較高的能量可引起原子的電離，導致起原子的電離，導致DNADNA的損傷，基因突變和染色體結構變異。的損傷，基因突變和染色體結構變異。( (六六) )黃曲霉素黃曲霉素B1(AFB1)B1(AFB1)：霉變的花生等食物中含有大量的霉變的花生等食物中含有大量的AFB1 AFB1 ，AFB1AFB1是一種強致癌劑。可在是一種強致癌劑。可在G G的的N-TN-T位形成一個加成復合物即產生無嘌呤位點，位形成一個加成復合物即產生無嘌呤位點，使使GCGC顛換為顛換為T-AT-A

20、，引起基因突變?？蓪е赂伟?，引起基因突變?？蓪е赂伟?其它誘變劑：如亞硝酸、羥胺（NH2OH）、氮蒽、疊氮化鈉（NaN3）等物質，均能引起染色體畸變和基因突變。尤其是疊氮化物在一定條件下可獲得較高的突變頻率，而且相當安全，無殘毒。亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2腺嘌呤（A） 次黃嘌呤（H） HNO2鳥嘌呤（G） 黃嘌呤（X） 這些反應及形成物均可在DNA復制中產生影響，主要是使堿基對發(fā)生轉換。正向遺傳學策略正向遺傳學策略ATHTHCGCmispairingmutation誘誘 變變 基因突變對遺傳信息的影響基因突變對遺傳信息的影響( (一）堿

21、基替換的影響：單個堿基替換如果發(fā)生在基因一）堿基替換的影響：單個堿基替換如果發(fā)生在基因編碼區(qū)，則會改變一個密碼子，可以引起蛋白質一級結編碼區(qū)，則會改變一個密碼子，可以引起蛋白質一級結構中某個氨基酸的變化。構中某個氨基酸的變化。 1 1 同義突變同義突變(samesense mutation) (samesense mutation) ：由于遺傳密：由于遺傳密碼具有簡并性。所以有時堿基替換密碼子改變但并不改碼具有簡并性。所以有時堿基替換密碼子改變但并不改變氨基酸。如變氨基酸。如GAUGACGAUGAC，但仍是天冬，但仍是天冬AAAA，無突變效應，無突變效應，密碼子的簡并性大大削弱了突變的危害性，

22、是密碼子的簡并性大大削弱了突變的危害性，是DNADNA的容的容錯機制。錯機制。 2 2 錯義突變錯義突變（missense mutationmissense mutation）：指堿基替換密）：指堿基替換密碼子改變引起氨基酸的改變。錯義突變使蛋白質一級結碼子改變引起氨基酸的改變。錯義突變使蛋白質一級結構改變，導致蛋白質活性和功能不同程度的改變。一般構改變，導致蛋白質活性和功能不同程度的改變。一般性質相似的氨基酸替換對蛋白質的影響小，而性質不同性質相似的氨基酸替換對蛋白質的影響小，而性質不同的氨基酸的替換可能強烈的影響蛋白質的功能。的氨基酸的替換可能強烈的影響蛋白質的功能。 3 3 無義突變無義

23、突變（nonsense mutation):nonsense mutation):堿基替換使編堿基替換使編 碼氨碼氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，轉錄出的基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，轉錄出的mRNAmRNA在翻譯時在翻譯時提前終止，形成的肽鏈不完全，一般沒有活性。形成的終提前終止，形成的肽鏈不完全，一般沒有活性。形成的終止密碼子為止密碼子為UAGUAG、UAAUAA或或UGA UGA 。 4 4 通讀通讀（reading through):reading through):堿基替換使終止密碼子突堿基替換使終止密碼子突 變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，轉錄出的變?yōu)榫幋a氨基酸的密碼子，轉錄出的mRNAm

24、RNA在翻譯時不能適在翻譯時不能適時終止，直到另一終止密碼子為止。時終止，直到另一終止密碼子為止。 移碼突變的影響：移碼突變的影響：在在DNADNA分子的外顯子中遺傳信分子的外顯子中遺傳信 息息是按三聯(lián)體密碼子排列的，插入或缺失個或個或個是按三聯(lián)體密碼子排列的，插入或缺失個或個或個堿基會改變閱讀框架，結果翻譯出來的蛋白質的氨基酸序堿基會改變閱讀框架，結果翻譯出來的蛋白質的氨基酸序列也完全改變，但如果插入或缺失個堿基，則在翻譯出列也完全改變，但如果插入或缺失個堿基，則在翻譯出的多肽鏈上只是多或少一個的多肽鏈上只是多或少一個AAAA，而不會完全打亂，而不會完全打亂AAAA序列。序列。 突變熱點和增

25、變基因：突變熱點和增變基因：理論上，理論上，DNADNA任何位點都可以發(fā)生突變，但實際上任何位點都可以發(fā)生突變，但實際上DNADNA分分子上不同部位有著不同的突變率。子上不同部位有著不同的突變率。 1 1 突變熱點突變熱點：突變率大大高于平均突變率的位點。如：突變率大大高于平均突變率的位點。如甲基胞嘧啶（甲基胞嘧啶（MeCMeC）的存在，）的存在，MeCMeC脫氨后生成脫氨后生成T T，不可被，不可被校正，而引起突變，校正，而引起突變，C C脫氨后變成脫氨后變成U U，容易被校正。另外，容易被校正。另外一些短的重復系列也易形成突變熱點，易發(fā)生嵌入和缺一些短的重復系列也易形成突變熱點，易發(fā)生嵌入

26、和缺失，因失，因DNADNA復制前模板鏈與新生鏈之間的滑動造成。復制前模板鏈與新生鏈之間的滑動造成。 2 2 增變基因增變基因（mutator genemutator gene）：指某些基因突變后可使）：指某些基因突變后可使整個基因組中的突變率明顯上升的基因。如整個基因組中的突變率明顯上升的基因。如DNADNA聚合酶基聚合酶基因突變，因突變，33校正功能降低或喪失，是基因突變率校正功能降低或喪失，是基因突變率升高。另如升高。另如damdam基因突變，則錯配修復功能喪失，引起突基因突變，則錯配修復功能喪失，引起突變率升高。變率升高。 射線誘變正向遺傳學策略正向遺傳學策略 在基因工程中，在基因工程

27、中，T -DNAT -DNA中的基因被中的基因被除掉，保留兩側的重復序列，加入除掉，保留兩側的重復序列，加入欲轉移的基因。在用欲轉移的基因。在用 T- DNA T- DNA 誘導誘導突變時，不用加入其它基因。突變時，不用加入其它基因。Transposition and transposable elements(Ac/Ds)誘誘 變變Ti plasmid130 bpT DNALBRB正向遺傳學策略正向遺傳學策略 TDNA誘誘 變變 vir genesInsertional mutagenesis by T-DNAWhen and Where Mutations HappenIn eukaryo

28、tes, mutations that occur in the somatic cells (somatic mutations) are not inherited; mutations that occur any time in the germ line are inherited. We usually measure the rate in mutations per gametesomatic mutationgerm line mutationGerm lineSoma突變體的篩選方法突變體的篩選方法 受細胞核內遺傳物質控制的遺傳現(xiàn)象，叫做受細胞核內遺傳物質控制的遺傳現(xiàn)象，叫

29、做細胞核遺傳（核遺傳）。細胞核遺傳（核遺傳）。母本母本父本父本母本母本父本父本正交正交子代子代反交反交子代子代正向遺傳學策略正向遺傳學策略 受細胞質內遺傳物質控制的遺傳現(xiàn)象，受細胞質內遺傳物質控制的遺傳現(xiàn)象，叫做細胞質遺傳。叫做細胞質遺傳。母本母本父本父本母本母本父本父本正交正交子代子代反交反交子代子代正向遺傳學策略正向遺傳學策略正向遺傳學策略正向遺傳學策略根據發(fā)生突變基因的性質，根據發(fā)生突變基因的性質，將眾多突變體分成不同的突將眾多突變體分成不同的突變系。稱為突變體篩選。變系。稱為突變體篩選。常用的篩選方法是互補檢驗常用的篩選方法是互補檢驗（complementation test）突變體篩

30、選突變體篩選正向遺傳學策略正向遺傳學策略互補檢驗（互補檢驗（complementation test） 以豌豆花色為例，野生型為紫色，以豌豆花色為例，野生型為紫色，現(xiàn)有一批突變體花色為白色，它們現(xiàn)有一批突變體花色為白色，它們是相同基因突變，還是不同基因突是相同基因突變，還是不同基因突變？變？ 假定突變都是隱性（假定突變都是隱性（recessive）突）突變。變。突變體篩選突變體篩選正向遺傳學策略正向遺傳學策略 互補檢驗互補檢驗假定兩個突變體基因型分別為假定兩個突變體基因型分別為aa 和和bb突變體篩選突變體篩選如果a與b是等位基因aaBBAAbbAaBb紫色wildtype白色mutant如果

31、a與b不是等位基因基因組圖譜基因組圖譜遺傳圖譜遺傳圖譜（genetic map）物理圖譜物理圖譜（physical map）遺傳圖譜遺傳圖譜（genetic map） 采用采用遺傳分析的方法遺傳分析的方法將基因或其它將基因或其它DNADNA序列標定在染色體上構建連鎖圖。序列標定在染色體上構建連鎖圖。遺傳標記遺傳標記q有可以識別的標記，才能確定目標的方位及彼此之有可以識別的標記，才能確定目標的方位及彼此之間的相對位置。間的相對位置。q構建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標構建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標記。記。q包括：包括： 形態(tài)標記形態(tài)標記 細胞學標記細胞學標記 生化標記生化

32、標記 DNA DNA分子標記分子標記多態(tài)性（多態(tài)性（polymophism）所有的標記都必須具有多態(tài)性所有的標記都必須具有多態(tài)性！v 花色：白色、紅色花色：白色、紅色v 株高：高、矮株高：高、矮v 血型：血型：A A、B B、O O型型v 淀粉：糯、非糯淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結果！所有多態(tài)性都是基因突變的結果！形態(tài)標記形態(tài)標記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標記又稱表型標記數(shù)量少數(shù)量少很多突變是致死的很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響受環(huán)境、生育期等因素的影響q 最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用

33、控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性的形狀、顏色，軀體的顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標記，分析它們連鎖關系及遺傳距離，繪制狀作為標記，分析它們連鎖關系及遺傳距離，繪制而成的。而成的。q 控制性狀的其實是基因，所以形態(tài)標記實質上就控制性狀的其實是基因，所以形態(tài)標記實質上就是基因標記。是基因標記。果果蠅蠅連連鎖鎖圖圖細胞學標記細胞學標記v明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結構特征和數(shù)量特征明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結構特征和數(shù)量特征 染色體的核型染色體的核型 染色體的帶型染色體的帶型 染色體的結構變異染色體的結構變異 染色體的數(shù)目變異染色體的數(shù)目變異v優(yōu)點：不受環(huán)境影響優(yōu)點：不受環(huán)境

34、影響v缺點：數(shù)量少、費力、費時、對生物體的生長發(fā)育缺點：數(shù)量少、費力、費時、對生物體的生長發(fā)育不利不利生化標記生化標記v 又稱蛋白質標記又稱蛋白質標記v 就是利用蛋白質的多態(tài)性作為遺傳標記。就是利用蛋白質的多態(tài)性作為遺傳標記。 如：同工酶、貯藏蛋白如：同工酶、貯藏蛋白v 優(yōu)點：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小優(yōu)點：數(shù)量較多，受環(huán)境影響小v 缺點：受發(fā)育時間的影響、有組織特異缺點：受發(fā)育時間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息性、只反映基因編碼區(qū)的信息DNADNA分子標記分子標記簡稱分子標記簡稱分子標記以以DNADNA序列的多態(tài)性作為遺傳標記序列的多態(tài)性作為遺傳標記優(yōu)點：優(yōu)點：v 不受時間和環(huán)境的

35、限制不受時間和環(huán)境的限制v 遍布整個基因組，數(shù)量無限遍布整個基因組，數(shù)量無限v 不影響性狀表達不影響性狀表達v 自然存在的變異豐富，多態(tài)性好自然存在的變異豐富，多態(tài)性好v 共顯性，能鑒別純合體和雜合體共顯性，能鑒別純合體和雜合體限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）v DNADNA序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對序列能或不能被某一酶酶切，相當于一對等位基因的差異。等位基因的差異。 v 如有兩個如有兩個DNADNA分子（一對染色體），一個具有分子（一對染色體），一個具有某一種酶的酶切位點，而另一個

36、沒有這個位點，某一種酶的酶切位點，而另一個沒有這個位點，酶切后形成的酶切后形成的DNADNA片段長度就有差異，即多態(tài)片段長度就有差異，即多態(tài)性。性。v 可將可將RFLPRFLP作為標記，定位在基因組中某一位作為標記，定位在基因組中某一位置上。置上。v人類基因組中有人類基因組中有10105 5個個RFLPRFLP位點，每一位點只有位點，每一位點只有兩個等位基因。兩個等位基因。RFLPRFLP分析分析微衛(wèi)星微衛(wèi)星（microsatellite）標記標記v微衛(wèi)星又稱為微衛(wèi)星又稱為簡單重復序列（簡單重復序列（simple sequence simple sequence repeatrepeat，SS

37、RSSR）。）。v這種重復序列的重復單位很短，常常只有這種重復序列的重復單位很短，常常只有2 2個、個、3 3個或個或4 4個核苷酸個核苷酸v如一條染色體如一條染色體TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC 另一染色體另一染色體 TCTTCTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCCGC，就構成就構成了多態(tài)性。了多態(tài)性。遺傳圖譜的構建方法遺傳圖譜的構建方法 v 理論基礎理論基礎: 連鎖與交換連鎖與交換v 基本方法基本方法: 兩點測驗法和三點測驗法兩點測驗法和三點測驗法植物遺傳圖譜的構建植物遺傳圖譜的構建v 選擇研究材料（親本）選擇研究材料（親本）v

38、 構建分離群體構建分離群體v 遺傳標記檢測遺傳標記檢測v 標記間的連鎖分析標記間的連鎖分析選擇親本選擇親本 要求親緣關系遠，遺傳差異大要求親緣關系遠，遺傳差異大 但又不能相差太大以導致引起子代不育。但又不能相差太大以導致引起子代不育。 對備選材料進行多態(tài)對備選材料進行多態(tài)( (差異差異) )性檢測，綜合測定結性檢測，綜合測定結果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺傳作圖親本。傳作圖親本。構建作圖群體構建作圖群體 標記間的連鎖分析標記間的連鎖分析v利用在兩個親本間有多態(tài)性的標記分析分離群體中利用在兩個親本間有多態(tài)性的標記分析分離群體中所有個體的基

39、因型所有個體的基因型v根據連鎖交換的情況，確定標記之間的連鎖關系和根據連鎖交換的情況，確定標記之間的連鎖關系和遺傳距離遺傳距離v有計算機軟件可以應用有計算機軟件可以應用遺傳圖譜的缺陷遺傳圖譜的缺陷v 分別率有限分別率有限v 人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個體子代個體v 測序要求每個標記的間隔小于測序要求每個標記的間隔小于100100kbkbv 實際是實際是599599kbkb精確性不夠精確性不夠經典遺傳學認為，交換是隨機發(fā)生的經典遺傳學認為，交換是隨機發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點基因組中有些區(qū)域是重組熱點倒位、重復等染色體結構變異會

40、限制交換重組倒位、重復等染色體結構變異會限制交換重組物理圖譜的構建物理圖譜的構建v 用用分子生物學方法分子生物學方法直接檢測直接檢測DNADNA標記在染標記在染色體上的實際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。色體上的實際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。v 有遺傳圖譜為什么還要構建物理圖譜？有遺傳圖譜為什么還要構建物理圖譜？ v遺傳連鎖圖。它是通過計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率重組頻率，確定他們的相對距離，一般用厘摩(cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)來表示。v物理圖譜是利用限制性內切酶將染色體切成片段，再根據重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離物理距離堿基對(bp) 或千堿基(k

41、b)或兆堿基(Mb)的圖譜。酵母酵母遺傳遺傳圖與圖與物理物理圖比圖比較較A A 遺傳圖遺傳圖B B 物理圖物理圖Comparison of genetic (likage) and physical mapsphysical (bp)physical (bp)genetic (cM)genetic (cM)ArabidopsisArabidopsischromchromosomosom IV IV 基于基于基因圖譜的基因分離技術基因圖譜的基因分離技術圖譜定位克隆，簡稱圖位克?。▓D譜定位克隆，簡稱圖位克?。∕ap-based cloning)1 1、原理：、原理：利用利用同源染色體的隨機交換和連

42、鎖不平衡同源染色體的隨機交換和連鎖不平衡的原的原理，理，先將與先將與某一特定性狀某一特定性狀相關聯(lián)的目的基因定位到相關聯(lián)的目的基因定位到染色體上，在目的基因的兩側確定一對與目的基因染色體上，在目的基因的兩側確定一對與目的基因緊密連鎖的緊密連鎖的分子標記分子標記，接著將位于兩個分子標記間，接著將位于兩個分子標記間的候選基因的候選基因DNADNA片段分離出來，最后再通過遺傳互補片段分離出來，最后再通過遺傳互補試驗鑒定出目的基因。試驗鑒定出目的基因。特點：特點： 在不知道基因所編碼蛋白信息的條件下分離基因。在不知道基因所編碼蛋白信息的條件下分離基因。要求：要求： 1 1、需要構建性狀上存在分離的群體

43、；、需要構建性狀上存在分離的群體； 2 2、高密度的分子標記圖譜進行連鎖分析；、高密度的分子標記圖譜進行連鎖分析； 3 3、需要獲得與性狀緊密連鎖的分子標記；、需要獲得與性狀緊密連鎖的分子標記； 4 4、高質量的基因組文庫；、高質量的基因組文庫；植物基因組遺傳圖譜的構建植物基因組遺傳圖譜的構建A、選擇親本B、構建作圖群體C、遺傳標記的染色體定位D、標記間的連鎖分析分子標記分子標記(Molecular markers)(Molecular markers) A DNA sequence that exists as two or more readily distinguished versio

44、ns and which can therefore be used to mark a map position on a genetic, physical or integrated genome map.即：同源染色體之間即：同源染色體之間DNADNA序列上的差異，用來序列上的差異，用來表示某個特定的染色體區(qū)段。表示某個特定的染色體區(qū)段。Indica (1)Japonica (1)CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATG- - - - - - - - - - -CGGCATATGCTATTTTCTTTGCATCTTTTAACTCTTTATGGTT

45、CTCTCATSTSs Sequence tagged sitesLeft primerIndica (40) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (51) TCCATC TTTTGTAGGCTATTTGAAGTTTGGGATTAATACAGTTGATGGTGIndica (40) - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

46、- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Japonica (101) CCACAATATATCGTGAATGGGCGCCTGCTGCACAGTAAGTTCTAATGTAGIndica (41) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTJaponica (151) TCATCCAGCTATTCGCTAATGTTTATGTGTTGTAGGAAATATGGATCACTRight primerInDels: insertions and deletions網站網

47、址Supplemental material for this paper/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.）http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbred map http:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center（U.S.A.） /aims/TAIR database*， homepage http:/www.arabidopsis.

48、orgRecombinant Inbred map（mirror site） /cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers /aboutcaps.htmlSequence table /cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection /SNPs.htmlCEREON collection of polymorphisms http:/www

49、./cereonSSLP markers/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR， genome annotations /tdb/athl/htmls/index.htmlDatabase of Ler sequences /tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Research Institute， genome annotations http:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS g

50、enome annotations http:/websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions http:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Resource （TAIR）Marker1ACAGAGTAGGAGGCAAAC GTCGCGCGTAACGTCACGCGTAACGCTACTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC.GCTA

51、CTTACACGGACAACAGAGTAGGAGGCAAAC .GCTACTTACACGGACAPrimerPrimer雜合=1-(1/2*1/2+ 1/2*1/2)10-20MarkerP1P2P1 P2PoolPoolChr-1Chr-2 Chr-3 Chr-4Chr-5交換率 50% 自由組合交換率50% F1F2Marker1MarkerPoolF1 PMarker1AGeneBCPCR 1.300PCR 1.300Marker1Marker2RRTarget geneM1M2RRRRRRRRRRTarget geneM1M2初步定位初步定位精細定位精細定位水稻半矮稈基因水稻半矮稈基因

52、sd1sd1的克隆的克隆圖位克隆法舉例圖位克隆法舉例1： 水稻半矮稈基因水稻半矮稈基因sd1sd1被稱為被稱為“綠色革命基綠色革命基因因”，MonnaMonna等人通過圖位克隆的方法克隆等人通過圖位克隆的方法克隆到，它是編碼赤霉素代謝合成途徑中一個到，它是編碼赤霉素代謝合成途徑中一個關鍵的酶關鍵的酶GA20GA20氧化酶。氧化酶。水稻高桿和半矮桿植株水稻高桿和半矮桿植株半矮桿半矮桿IndicajaponicaHabatakiSasanishikiF1正常株高正常株高SasanishikiSBIL5Marker assistedSelection (MAS)Chr 1SBIL5 F2 segre

53、gating population (n=263)sd-1 can be treated as a mendelian factor in this population水稻半矮桿基因的精細定位水稻半矮桿基因的精細定位通過對通過對34773477個個分離單株的分分離單株的分子標記檢測子標記檢測（CAPSCAPS、SNPSNP等）找到了一等）找到了一個個6kb6kb的候選的候選基因區(qū)域?；騾^(qū)域。水稻分蘗基因的克隆水稻分蘗基因的克隆圖位克隆法舉例圖位克隆法舉例2： 理想株型是當前國內外超級稻研究中的一個核理想株型是當前國內外超級稻研究中的一個核心領域，即通過改變水稻在分蘗、莖稈、穗粒心領域，即通

54、過改變水稻在分蘗、莖稈、穗粒等方面的結構特點，提高水稻產量。等方面的結構特點，提高水稻產量。 對于分蘗基因的克隆及機理研究有助于促進水對于分蘗基因的克隆及機理研究有助于促進水稻稻稈壯穗大的理想株型稈壯穗大的理想株型的實現(xiàn)，在高產育種中的實現(xiàn)，在高產育種中具有重要應用前景。具有重要應用前景。 水稻分蘗是在基部不延長的節(jié)間形成，并獨立與主桿生水稻分蘗是在基部不延長的節(jié)間形成，并獨立與主桿生長。水稻分蘗的發(fā)生分二個階段：腋芽形成和生長。長。水稻分蘗的發(fā)生分二個階段：腋芽形成和生長。我國李家洋實驗室克隆我國李家洋實驗室克隆到了控制水稻分蘗的基到了控制水稻分蘗的基因因MONOCULM1（MOC1）。）。

55、The moc1突變體只有一根突變體只有一根主桿，沒有分蘗，因為主桿，沒有分蘗，因為不能形成分蘗芽。不能形成分蘗芽。 通過通過PCR方法將方法將MOC1和和moc1基因擴增出，基因擴增出，序列比較后發(fā)現(xiàn)有一個序列比較后發(fā)現(xiàn)有一個1.9kb的反向轉座因子插入的反向轉座因子插入到到moc1突變體的突變體的ORF中。功能互補試驗證明帶有中。功能互補試驗證明帶有完整的完整的ORF和和1.5kb上游啟動子序列的克隆上游啟動子序列的克隆pC8247能恢復分蘗性狀（圖能恢復分蘗性狀（圖1）。但是，）。但是，C-端截端截短的克隆短的克隆pC8247S不能恢復分蘗特性。不能恢復分蘗特性?？偪?結結1、從性狀的差

56、異到基因，屬于正向遺傳學范疇；、從性狀的差異到基因，屬于正向遺傳學范疇；2、親本選擇性狀上存在顯著差異的材料，獲得性狀、親本選擇性狀上存在顯著差異的材料，獲得性狀分離的后代群體；分離的后代群體；3、親本選擇秈稻、粳稻亞種，便于發(fā)展高密度的分子、親本選擇秈稻、粳稻亞種，便于發(fā)展高密度的分子標記；標記；4、通過尋找交換單株來確定緊密連鎖的兩側分子標、通過尋找交換單株來確定緊密連鎖的兩側分子標記；記；5、利用基因組文庫或、利用基因組文庫或PCR的方法分離獲得特殊功能的的方法分離獲得特殊功能的基因?；颉４嬖诘膯栴}存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術來定位

57、基因。在分析自然發(fā)生的變異的時候，我們最有可能遇到的復雜情況是一個給定的性狀是由不止一個的基因位點控制的。例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之間的雜交實驗中，我們發(fā)現(xiàn)粉狀霉菌抗性基因至少涉及三個遺傳位點，它們是以附加的方式起作用的（I.Wilson， C. Schiff， 和 S. Somerville， 個人交流）。對這些抗性基因中的任何一個作精細定位都要求降低作圖群體的遺傳復雜性，例如通過創(chuàng)造只有一個位點保持多態(tài)性的重組近交系。在擬南芥的株系之 間雜交時，很多種性狀是由一個或多個遺傳位點控制的，其中包括開花時間，種子大小，冬眠，生理節(jié)律，次生代謝以及表皮

58、毛的密度（綜述見Alonso-Blanco 和 Koornneef，2000）。無論何時，當影響這些性狀的自然或者誘導的突變被定位的時候，第二位點修飾成分會干擾這些分析。表觀（上位）遺傳突變這個術語是描述一個基因在表達和功能上的可遺傳改變，而不涉及DNA序列的改變（綜述見Wolffe 和 Matzke,1999），已有文獻很好地證明的是花發(fā)育基因SUPERMAN的后生clark kant等位基因（Jacobson 和 Meyerowitz，1997）。這些等位基因是可遺傳的，但它們不穩(wěn)定有一個小的回復率。它們在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化現(xiàn)象，結果，有可能減少了S

59、UPERMAN基因轉錄子的表達。它們中沒有一個是和SUPERMAN的DNA序列改變聯(lián)系在一起的；盡管如此，它們能被帶有SUPERMAN基因的轉基因所補充。目前，對于這種表觀遺傳突變是怎么產生的以及它們出現(xiàn)的頻率知道的不多。關于染色體上位點的物理和遺傳距離的比值是變化的。通常這種變化是比較小的，對作圖的分辨率也只有較小的影響（Copenhaver等，1998）。但是，有證據表明有些染色體區(qū)域是例外的。例如，對GURKE基因的圖位克隆就非常困難，這個基因的定位接近于第一條染色體的著絲粒；在著絲粒附近重組是嚴格限制的，使得對它精細定位的努力非常無效。而且，在這個區(qū)域中重復DNA單元的廣泛分布使我們辨

60、認出散布的單拷貝序列，這些單拷貝序列能產生有疑問的遺傳標記（R. Torres Ruiz，個人交流）。這個發(fā)現(xiàn)是經過對第二條染色體上的物理和遺傳距離之間的比值的系統(tǒng)地分析之后確認的（Lin等，1999）。對這條染色體的幾乎全序列，1%重組的遺傳距離相當于100400 Kb的物理距離，平均是250 Kb。然而著絲粒區(qū)域是一個顯著的例外，在這里1%重組的遺傳距離相當于10002500 Kb?？磥碇档弥赋龅氖窃诂F(xiàn)存的物理圖譜中，擬南芥的五個著絲粒是沒有一個被完全覆蓋的。最近對著絲粒區(qū)域的分析顯示這些區(qū)域通常包含重復的DNA和幾乎不含表達的基因（Copenhaver等，1999）。因此，由于接近著絲粒