測定核酸含量的幾種方法

1、Company Logo測定核酸含量的幾種方法命基111 10111104 朱家民Company Logo核酸u 由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。u 核酸廣泛存在于所有動(dòng)植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)的核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。u 不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。Company Logo為什么要測核酸含量u 有助于接下來核酸相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用酶和其他試劑含量的確定u 為了排除核酸在實(shí)驗(yàn)中的干擾Company Logo核酸含量測定的幾種方法u 定磷法u 定糖法u 紫外吸收法u

2、 熒光光度法Company Logo定磷法u 在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中的磷酸反應(yīng)生成磷鉬酸，當(dāng)有還原劑存在時(shí)磷鉬酸立即轉(zhuǎn)變藍(lán)色的還原產(chǎn)物鉬藍(lán)u 鉬藍(lán)最大的光吸收在650660nm波長處。當(dāng)使用抗壞血酸為還原劑時(shí)，測定的最適范圍為110微克無機(jī)磷。測定樣品核酸總磷量，需先將它用硫酸或過氯酸消化成無機(jī)磷再行測定?？偭琢繙p去未消化樣品中測得的無機(jī)磷量，即得核酸含磷量，由此可以計(jì)算出核酸含量。u 優(yōu)缺點(diǎn)：簡單，快速，靈敏度高，但是受蛋白質(zhì)和核苷酸的影響Company Logo注意事項(xiàng)u 1）清洗實(shí)驗(yàn)用容器不要用含磷清洗劑 u 2）消化過程注意防止爆沸和濺出內(nèi)容物Company

3、 Logo定糖法u 核酸中的戊糖可在濃鹽酸或濃硫酸作用下脫水生成醛類化合物，醛類化合物可與某些成色劑縮合成有色化合物，可用比色法或分光光度法測定其溶液中的吸收值，在一定濃度范圍內(nèi)，溶液的吸收值與核酸的含量成正比。u 1、核糖的測定 生成的綠色化合物在=670nm處有最大的吸收值。u 2、脫氧核糖的測定 DNA中的脫氧核糖可在濃硫酸作用下脫水生成-羥基-酮戊酸，該化合物可與二苯胺生成蘭色化合物，在=595nm處有最大吸收值。優(yōu)缺點(diǎn)：較靈敏，但特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)。 Company Logo注意事項(xiàng) 其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白質(zhì)等都對實(shí)驗(yàn)有干擾，測定前應(yīng)盡量可能除去。Company

4、Logo紫外吸收法u 組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長為250270nm之間。核酸的最大吸收波長是260nm，這個(gè)物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。u 在波長260nm紫外線下，1OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA或RNA為20g/ml?？梢源蝸碛?jì)算核酸樣品的濃度。u 優(yōu)缺點(diǎn)：只用于測定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液Company Logo熒光光度法u 即瓊脂糖凝膠電泳法。u 溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，它插入到DNA分子中形成熒光結(jié)合物，使發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為電泳對照，就可以估計(jì)出待測樣品的濃度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼觀察可檢測0.05g-0.1g的DNA。u 該方法只是估計(jì)水平，另外還應(yīng)考慮DNA或RNA樣品中分子大小與標(biāo)準(zhǔn)對照中核酸分子的長度。Company Logo小節(jié)u 根據(jù)不同情況以及實(shí)驗(yàn)條件選擇合適