體外培養(yǎng)的人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種造血生長因子

1、體外培養(yǎng)的人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)多種造血生長因子    作者：陳惠芹，張緒超，唐新意2，吳北燕，黃紹良 【摘要】 本研究檢測人胚胎主動脈性腺中腎（AGM）區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子，為探討AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞在胚胎造血發(fā)生中的作用及其造血支持作用提供基礎(chǔ)資料。采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞（hAGMS1-S5）的表達(dá)情況，應(yīng)用ELISA法測定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的分泌水平，并將臍血CD34細(xì)胞與hAGM

2、S1-S5飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)14天后行造血細(xì)胞集落培養(yǎng)以進(jìn)一步檢測人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的造血支持作用。結(jié)果表明： hAGMS1-S5均表達(dá)IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生長因子mRNA，不表達(dá)IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMS1-S5細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可測得分泌的SCF、Flt3-L、IL-6等因子，hAGMS1-S5組間比較各因子水平無顯著性差異（P>0.05）。集落培養(yǎng)結(jié)果表明，hAGMS1-S5對CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix均有不同程度的擴(kuò)增作用， hAGMS1-S5的造血支持作用組間比較亦顯示有顯著性差異（P<0.05），

3、其中hAGMS3、S4優(yōu)于S1、S2及S5。結(jié)論： 人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SCF、Flt3-L、IL-6、OSM等多種造血生長因子，這可能與AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞支持造血細(xì)胞原始發(fā)生和體外維持造血干細(xì)胞功能相關(guān)。    【關(guān)鍵詞】 主動脈性腺中腎區(qū)；基質(zhì)細(xì)胞；造血生長因子 Hematopoietic Growth Factors Expressed in Human Aorta-Gonad- Mesonephros (AGM)-Derived Stromal Cells in vitro AbstractThis study was aimed to inve

4、stigate the hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros (AGM)-derived stromal cells in vitro in order to provide the basic data for elucidating the role of AGM -derived-stromal cells in embryo-hematopoiesis and its hematopoietic suppoitive effect. RT-PCR was used to analy

5、ze the expression of IL-6, SCF, Flt3-L, oncostatin M(OSM), IL-3, TPO, M-CSF and LIF in human aorta-gonad- mesonephros-derived stromal cells (hAGMS1-S5) at mRNA level. IL-6, SCF and Flt3-L levels were detected in the supernatant of hAGMS1-S5 stromal cells by ELISA assay. Umbilical cord blood CD34 cel

6、ls were cocultured with hAGMS1-S5 feeder cells , and hematopoietic cells were collected at day 14 for colony analysis in methylcellulose semisolid medium. The results showed that human aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells S1-S5 expressed IL-6, SCF, Flt3-L and OSM mRNA, but did not express I

7、L-3, TPO, M-CSF and LIF mRNA. In the supernatant of hAGMS1-S5 cells, IL-6, SCF and Flt3-L could be detected by ELISA assay at different levels, while there was no significant difference between groups of hAGMS1-S5 (P>0.05). When cocultured with umbilical cord blood CD34cells, hAGMS1-S5 could supp

8、ort the expansion of CFU-GM, BFU-E, and CFU-Mix. The supportive effects of hAGM S1-S5 were significantly different (P<0.05), hAGM S3 and S4 were better than hAGM S1, S2, and S5. It is concluded that detection of hematopoietic growth factors expressed in human aorta-gonad-mesonephros-derived strom

9、al cells provided a solid foundation to elucidate the mechanism of hematopoiesis and the hematopoietic supportive effect of these stromal cells. Key wordsaorta-gonad-mesonephros; stromal cell; hematopoietic growth factor 近年研究表明，主動脈性腺中腎（aorta-gonad-mesonephros， AGM）區(qū)是哺乳動物胚胎期永久造血（definitive hematopoie

10、sis）的起源部位，該區(qū)的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有向粒系、紅系、淋巴系等造血各系分化的能力1-3。作為多潛能HSC出現(xiàn)的最早部位，AGM區(qū)具有胚胎造血發(fā)生發(fā)育所需的重要微環(huán)境，正成為國際上造血發(fā)生、分化機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。本研究首次對體外培養(yǎng)中的人胚胎AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子進(jìn)行了檢測，為探討AGM區(qū)造血微環(huán)境在胚胎造血發(fā)生中的作用及其造血支持作用研究提供基礎(chǔ)資料。 材料和方法 主要試劑 -MEM、馬血清、-巰基乙醇、Glutamax-I（Gibco公司產(chǎn)品），胎牛血清（Hyclone公司產(chǎn)品），氫化可的松、絲裂霉素C（Sigma公司產(chǎn)品

11、），總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒（Invitrogen公司產(chǎn)品），瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)記（Biolabs公司產(chǎn)品），人IL-6、SCF ELISA 試劑盒(晶美生物工程有限公司產(chǎn)品)，人Flt3-L ELISA試劑盒（R&D Systems公司產(chǎn)品）， CD34細(xì)胞分選試劑盒（德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品），造血細(xì)胞長期培養(yǎng)基MethoCultTM H5100及造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)基MethoCultTM GF H4435（加拿大Stem Cell 公司產(chǎn)品）。 人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 收集經(jīng)米非司酮及米索前列醇藥物流產(chǎn)的30-35天的人胚胎，按本室方法，已建

12、立5株人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞，分別命名為hAGMS1-S54。分別取第5代的hAGMS1-S5細(xì)胞，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶，其中培養(yǎng)液含有20胎牛血清、5馬血清、10 mol/L -巰基乙醇、2 mmol/L Glutamax-I及1 mol/L 氫化可的松的-MEM。并置于37、5 CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 造血生長因子mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測 使用TRIZOL試劑，按說明分別提取hAGMS1-S5細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒操作說明進(jìn)行。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列分別為SCF：上游5- GTCATTGTTGGATAAGCGAGAT -3，下游5-AT

13、GGCTGCCCAGTGTAGG-3，PCR產(chǎn)物長度為457 bp； Flt3-L：上游5- CTGGAGCCCAACAACCTATCT -3，下游5- CCAGCGACAGTCTTGAGCC -3，PCR產(chǎn)物長度為252 bp； IL-3：上游5- TTTGCCTTTGCTGGACTT -3，下游5- TTCCAGTCACCGTCCTTG -3，PCR產(chǎn)物長度為222 bp； IL-6：上游5- GAGGGCTCTTCGGCAAAT -3，下游5- CTGGCTCTGAAACAAAGGATAT -3，PCR產(chǎn)物長度為313 bp； M-CSF：上游5- TGCGTCCGAACTTTCTATG

14、 -3，下游5- CACTGCTAGGGATGGCTTT -3，PCR產(chǎn)物長度為202 bp； TPO：上游5- ATTGCTCCTCGTGGTCAT -3，下游5- CTCCTCCATCTGGGTTTT -3，PCR產(chǎn)物長度為220 bp； LIF：上游5-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3，下游5- ATTTGGGTTTAGCGATGC-3，PCR產(chǎn)物長度為399 bp； OSM：上游5- GCTGGACAACTCAGACACG -3，下游5- AACACGGAAAGGAGGAAGT -3，PCR產(chǎn)物長度為697 bp。 PCR擴(kuò)增條件： 94預(yù)變性2分鐘，然后94變性45秒，52

15、退火45秒，72延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在1瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。    造血生長因子水平的ELISA檢測 分別取第5代的hAGMS1-S5細(xì)胞接種于24孔板，每樣本復(fù)種3孔，每孔培養(yǎng)體系1 ml。培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)70-80時(shí)換液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集培養(yǎng)液，離心后取上清，分裝，貯于-20備用。按ELISA試劑盒操作說明測定hAGMS1-S5細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、SCF和Flt3-L水平。 臍血CD34 細(xì)胞與hAGMS1-S5飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)后的集落形成能力分析 分別取第5代的hAGMS1-S5細(xì)胞，接種至24

16、孔板，細(xì)胞融合達(dá)80-90時(shí)予絲裂霉素C（濃度10 g/ml）處理2小時(shí)，經(jīng)PBS洗3次后加基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37、5 CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中備用。采集本院產(chǎn)房出生的正常足月新生兒的臍血，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心分離得到臍血單個(gè)核細(xì)胞后，按照CD34 細(xì)胞分選試劑盒說明，采用免疫磁珠法進(jìn)行CD34 細(xì)胞的分離純化。將純化的臍血CD34 細(xì)胞按2.0×104/孔接種于已制備好hAGMS1-S5飼養(yǎng)層的24孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)體系中飼養(yǎng)層的種類不同分為6組：無飼養(yǎng)層組（對照組）、hAGMS1-S5飼養(yǎng)層組，培養(yǎng)液均為含1 mol/L 氫化考的松（hydrocortiso

17、ne）的H5100（其成分為-MEM含12?5胎牛血清、12?5馬血清、10 mol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷胺酰氨、0.2 mmol/L i-肌醇、16 mol/L葉酸），置于37、5 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3-4天半量換液1次。培養(yǎng)14天時(shí)收獲造血細(xì)胞（收獲細(xì)胞具體方法見參考文獻(xiàn)5）制成單個(gè)核細(xì)胞懸液，用甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)法測定其集落形成能力，培養(yǎng)液為H4435 (其成分為IMDM中含1.0甲基纖維素，30胎牛血清，1 BSA, 10-4mol/L 2-巰基乙醇，2 mmol/L L-谷胺酰氨，50 ng/ml rhSCF, 20 ng/ml rhGM-C

18、SF, 20 ng/ml rhIL-3, 20 ng/ml rhIL-6, 20 ng/ml rhG-CSF, 3 U/ml rhEPO)，置于37、5 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14天時(shí)計(jì)數(shù)粒單系集落形成單位（CFU-GM）、紅系爆式集落形成單位（BFU-E）和混合集落形成單位（CFU-Mix）。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0軟件包中單因素方差分析組間差異。 結(jié)果 人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng) 第5代的hAGMS1-S5細(xì)胞在體外均生長迅速，呈貼壁生長。經(jīng)4-5天細(xì)胞長滿，其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)主要為成纖維間質(zhì)細(xì)胞樣，少量呈內(nèi)皮樣，是早期胚胎A

19、GM區(qū)來源的異質(zhì)細(xì)胞群（圖1）。    造血生長因子mRNA水平表達(dá)檢測 RT-PCR檢測結(jié)果顯示,人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞S1-S5均表達(dá)IL-6、SCF、Flt3-L和OSM等造血生長因子mRNA，不表達(dá)IL-3、TPO、M-CSF及LIF等細(xì)胞因子mRNA（圖2）。 人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞分泌造血生長因子水平檢測 hAGMS1-S5細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6、SCF和Flt3-L的分泌水平見表1，hAGMS1-S5組間比較各因子水平無顯著性差異（P>0.05）。Table 1. Levels of factors IL-6, SCF and Flt3-

20、L secreted by hAGMS1-S5 stromal cells (略) 臍血CD34 細(xì)胞與hAGMS1-S5飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)后的集落形成能力    集落培養(yǎng)結(jié)果表明，hAGMS1-S5能維持CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix等各系集落形成，共培養(yǎng)后CFU-GM、BFU-E 、CFU-Mix均有不同程度的擴(kuò)增，與無飼養(yǎng)層組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2），提示造血微環(huán)境來源的AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞能體外維持造血干/祖細(xì)胞的不被完全耗竭，并具有多系造血能力。hAGMS1-S5組間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05

21、），其中hAGMS3、S4組優(yōu)于S1、S2、S5組，但hAGMS3、S4兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Table 2. Effect of hAGMS1-S5 cells on the expansion of hematopoietic colony formation cells (略) 討論 哺乳動物胚胎期造血發(fā)生分為原始造血（primitive hematopoiesis）和永久造血（definitive hematopoiesis）兩個(gè)過程。在原始造血過程中，位于胚外的卵黃囊產(chǎn)生有核紅細(xì)胞及少量巨噬細(xì)胞，并提供早期胚胎生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。隨著胚胎的發(fā)育，原始造血

22、被永久的多系造血所取代，永久造血的多潛能HSC具有自我更新和多向分化的能力。AGM區(qū)是多潛能HSC出現(xiàn)的最早區(qū)域，該區(qū)的微環(huán)境對永久造血的發(fā)生提供了必要的啟始條件，闡明其作用機(jī)制對造血系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育的基礎(chǔ)研究及HSC工程研究都具有重要意義。AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞及其分泌的造血生長因子為HSC的產(chǎn)生提供了合適的造血微環(huán)境，具有重要的研究價(jià)值。迄今為止，已有兩個(gè)研究小組建立了小鼠AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞系并證實(shí)其具有造血支持作用6,7。2005年本課題組首次從孕30-35天的人胚胎取材培養(yǎng)出5株人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞（hAGMS1-S5）4，并證實(shí)hAGMS1-S5具有造血支持作用，對臍血長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞（long-

23、term culture-initiating cell，LTC-IC）具有維持及適度的擴(kuò)增作用5。造血生長因子是影響造血細(xì)胞增殖、分化的一群調(diào)控因子。Xu等6應(yīng)用RT-PCR方法對小鼠AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示小鼠AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SCF、IL-6和OSM等mRNA,不表達(dá)G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、M-CSF、LIF、TPO等mRNA。有關(guān)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)造血生長因子的研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用RT-PCR方法對我們所建立的5株人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SCF、Flt3-L

24、、IL-6、OSM等造血生長因子mRNA，不表達(dá)IL-3、M-CSF、LIF 、TPO等因子mRNA，與小鼠AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子相一致。此結(jié)果亦提示，作為永久HSC的最早產(chǎn)生部位，AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的造血生長因子主要是作用于早期造血干/祖細(xì)胞的因子。為進(jìn)一步明確這幾種造血生長因子在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，本研究應(yīng)用ELISA方法檢測了其在人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的分泌水平，結(jié)果顯示在hAGMS1-S5均可測得蛋白質(zhì)水平的SCF、Flt3-L和IL-6等造血生長因子，不同株細(xì)胞分泌因子水平相當(dāng)。SCF是c-kit的配體，它是作用于最早期造血干/祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，其主要生物學(xué)活性

25、為刺激最原始的HSC增殖并促進(jìn)其向定向造血祖細(xì)胞分化生長。Flt3-L是酪氨酸激酶受體3的配體，與SCF有一定的同源性，其作用與SCF相類似，作用于早期造血干/祖細(xì)胞，與其他造血生長因子協(xié)同促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞的自我更新、增殖和分化。IL-6主要由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，T細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和其他間質(zhì)組織細(xì)胞也都能產(chǎn)生，主要作用于多潛能祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化。OSM除抑制腫瘤細(xì)胞生長外，還具有多種生理功能，是細(xì)胞生長與分化的重要調(diào)節(jié)因子8,9，對造血干/祖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用。Mukouya-ma8等采用RT-PCR及原位雜交的方法均檢測到孕11.5天小鼠胚胎的AGM區(qū)組織表達(dá)OS

26、M mRNA，為進(jìn)一步探討OSM在AGM區(qū)造血發(fā)生中的作用，他們分離小鼠胚胎的AGM區(qū)組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSM不僅可促進(jìn)AGM區(qū)的HSC擴(kuò)增，還同時(shí)促進(jìn)AGM區(qū)內(nèi)皮樣細(xì)胞的擴(kuò)增，推測OSM可能是通過作用于造血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的共同前體細(xì)胞成血血管細(xì)胞而發(fā)揮作用的。本研究證實(shí)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞亦表達(dá)OSM mRNA，因目前無OSM ELISA試劑盒，未能對其在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的分泌水平進(jìn)行檢測。近年來血管內(nèi)皮發(fā)生與造血發(fā)生發(fā)育之間的關(guān)系日漸引人關(guān)注，本課題組對人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析亦發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的基因如TEK、HEY210，為闡明AGM區(qū)血管發(fā)生與造血發(fā)生

27、發(fā)育之間的關(guān)系提供了重要的線索。為進(jìn)一步證實(shí)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞的造血支持作用，本研究將臍血CD34 細(xì)胞與hAGMS1-S5共培養(yǎng)后檢測其造血集落形成能力，結(jié)果提示CFU-GM、BFU-E及較早期的造血集落CFU-Mix均有不同程度的擴(kuò)增，這更進(jìn)一步從功能上表明人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)及維持一定量的早期造血干/祖細(xì)胞的增殖。AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞可能通過與造血細(xì)胞的直接接觸、分泌多種造血生長因子調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的生長、發(fā)育、增殖及分化。5株人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞S1-S5的造血支持作用組間比較亦顯示有顯著性差異，其中hAGMS3、S4優(yōu)于S1、S2及S5。但RT-PCR及ELISA檢測結(jié)果顯示hAGMS1-

28、S5細(xì)胞表達(dá)IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生長因子的種類及其分泌水平無顯著性差異，因此AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞可能還通過分泌其他的調(diào)控因子發(fā)揮造血支持作用，值得進(jìn)一步深入研究。    【參考文獻(xiàn)】 1 Dzierzak E. Ontogenic emergence of definitive hematopoietic stem cells. Curr Opin Hematol, 2003; 10: 229-2342 Cumano A, Ferraz JC, Klaine M, et al. Intraembryonic, but not yolk

29、 sac hematopoietic precursors, isolated before circulation, provide long-term multilineage reconstitution. Immunity, 2001; 15: 477-4853 Tavian M, Robin C, Coulombel L, et al. The human embryo, but not its yolk sac, generates lympho-myeloid stem cells: mapping multipotent hematopoietic cell fate in intr