GBLP相互作用蛋白研究

1、所屬專業(yè)：應(yīng)用藥理學(xué)GBLP相互作用蛋白研究邱峰1)，毛小琴2)，陳世知3)，邱宗蔭2) * (1) 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016； 2) 重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；3) 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）摘要 為了進(jìn)一步闡明GBLP在普萘洛爾（PRO）生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生機(jī)制中的作用，本文采用免疫共沉淀法結(jié)合HPLC-CHIP-IT-MS/MS系統(tǒng)篩選并鑒定了GBLP相互作用蛋白。結(jié)果表明，有7種蛋白與GBLP存在相互作用，分別為Casein a-S1、Casein a-S2、b casein、橋粒芯蛋白1前體、a-烯醇化酶、果糖二

2、磷酸醛縮酶C、硫氧還原蛋白過(guò)氧化物酶2。這些蛋白的生物信息學(xué)檢索結(jié)果提示，GBLP可能參與了細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié)和抗氧化機(jī)制，與PRO的生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。關(guān)鍵詞 普萘洛爾；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；GBLP；免疫共沉淀；液相色譜-芯片-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜Screening and identification of GBLP interactional proteinsQIU Feng 1), MAO Xiao-Qin 2), CHEN Shi-Zhi 3), QIU Zhong-Yin 4)* ,JIA Xiong-Fei5)(1) the First Affiliated Hospital,

3、Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2) Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics of Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 3) the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China)Abstract To further elu

4、cidate roles of GBLP in biological characteristics mechanism of propranolol (PRO), Co-immunoprecipitation and HPLC-CHIP-IT-MS/MS were used to screen and identity interactional proteins of GBLP. The results showed that 7 proteins might interact with GBLP, which are casein a-S1, casein a-S2, b casein,

5、 desmoglein 1 precursor, a-enolase, fructose-bisphosphate aldolase C and peroxiredoxin 2. Bioinformatics of these proteins hinted that GBLP might participate energy metabolism regulation and antioxidation in cells, which closely correlated to biological characteristics mechanism of PRO.Key words pro

6、pranolol; human umbilical vein endothelial cell; GBLP; Co-immunoprecipitation; HPLC-CHIP-IT-MS/MS基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.CSTC-2005BB5227）作者簡(jiǎn)介：邱峰，男，副主任藥師 * 通訊作者： 邱宗蔭，男，教授，博士研究生導(dǎo)師 TELEmail: zongyin在過(guò)去的工作中，我們采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略研究了普萘洛爾（PRO）對(duì)映異構(gòu)體R(+)/S(-)-PRO誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，在所鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)G

7、蛋白b亞單位2樣1蛋白（GBLP）在R(+)-PRO干預(yù)后的HUVEC中高表達(dá)1。GBLP是新近發(fā)現(xiàn)的RACK家族成員之一，又稱為活化的蛋白激酶C受體1（RACK1），是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子的底物和相互作用蛋白2-3。已知GBLP可與蛋白激酶C（PKC）結(jié)合，作為細(xì)胞內(nèi)受體使活化的PKC錨定于細(xì)胞骨架，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)。例如，GBLP可能在2腎上腺素受體（2-AR）介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用，它可使受體發(fā)生非特異性脫敏（磷酸化），當(dāng)沉默RACK1基因后，可顯著減少2-AR的磷酸化3；RACK1還可連結(jié)兩個(gè)PKC亞型，從而調(diào)節(jié)PKC介導(dǎo)的心肌肥厚信號(hào)4。GBLP的這些作用可能與PRO保護(hù)

8、心肌細(xì)胞、抗氧化、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生等生物學(xué)效應(yīng)和立體選擇性的發(fā)生機(jī)制有重要關(guān)系，但目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究分別用PRO對(duì)映異體作用于HUVEC，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)（LSCM）比較分析細(xì)胞內(nèi)GBLP的表達(dá)情況和定位，再以免疫共沉淀法（Co-IP）和高效液相色譜-芯片-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（HPLC-CHIP-IT-MS/MS）篩選、鑒定HUVEC中的GBLP相互作用蛋白。希望通過(guò)本研究，進(jìn)一步了解GBLP的功能，以及在PRO生物學(xué)效應(yīng)及立體選擇性機(jī)制中的作用。1 材料與方法1.1 HUVEC細(xì)胞株HUVEC細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)燒傷研究所饋贈(zèng)。1.2 試劑與

9、儀器R(+)/S(-)-PRO、羊抗兔IgG-Cy3（Sigma公司），ReadyStrip IPG Strip（pH 3-10，17 cm，linear）、Pharmalyte（pH 3-10）、30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺（29:1）、PVDF膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒（Bio-Rad公司），羊抗兔IgG-HRP、蛋白A-瓊脂糖（Pierce公司），哺乳動(dòng)物細(xì)胞全蛋白提取試劑盒（BioVision公司）、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（Promega公司）、兔抗人GBLP多抗（Santa Cruz Biotechnology公司）、正常兔血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、-tubulin單抗（Epitomi

10、cs公司）、正常兔血清封閉液、WB封閉劑（上海博士德公司）、預(yù)染蛋白質(zhì)marker（MBI公司）、Co-IP試劑盒（美國(guó)Roche公司）。SDS-PAGE垂直電泳槽（Bio-Rad公司）、EDAS 290 掃描儀（Kodak公司）、LSCM（TCS 公司）、高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）、DYCZ-24D垂直電泳槽（北京六一儀器廠）、HPLC-CHIP/MS、HPLC-CHIP（Agilent 1100 Series HPLC systems）、Ion Trap LC/MSD trap 6300質(zhì)譜儀（Agilent Technologies）。1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞株培養(yǎng)

11、于含10新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將密度一致的細(xì)胞瓶分為兩組，分別用80 mmol/L的R(+)/S(-)-PRO作用細(xì)胞2 h后，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。1.4 細(xì)胞內(nèi)GBLP的表達(dá)情況及定位1.4.1 WB分析：以-tubulin為內(nèi)參蛋白。取等量分別經(jīng)R(+)/S(-)-PRO處理的HUVEC總蛋白（25 g），12% SDS-PAGE電泳分離，移至PVDF膜，5%脫脂奶4封閉；加入兔抗人GBLP多抗與兔抗人-tubulin單抗室溫1 h；加入羊抗兔IgG-HRP室溫1 h；化學(xué)發(fā)光法顯色，EDAS 290 掃描成像。目的蛋白相對(duì)含量以A表示（A=目的蛋白帶發(fā)光強(qiáng)度/同泳道內(nèi)參蛋白帶

12、發(fā)光強(qiáng)度），比較GBLP表達(dá)豐度差異，并t檢驗(yàn)。1.4.2 LSCM分析：細(xì)胞貼壁爬片后，分別用80 mmol/L的R(+)/S(-)-PRO作用2 h，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，正常兔血清封閉；加兔抗人GBLP多抗4過(guò)夜；加羊抗兔IgG- Cy3室溫2 h；LSCM觀察細(xì)胞內(nèi)GBLP的表達(dá)和定位。1.5 Co-IP試驗(yàn)1.5.1 蛋白質(zhì)樣品制備：收集對(duì)照組、R(+)/S(-)-PRO組的細(xì)胞各1×107個(gè)，加入1ml細(xì)胞裂解液。1.5.2 去除非特異性結(jié)合：取蛋白質(zhì)量約為500 mg的上述樣品，加入約1 mg正常兔血清IgG和20 ml充分重懸的蛋白A-瓊脂糖，4搖動(dòng)3 h，離

13、心，取上清液備用。1.5.3 免疫共沉淀：取0.4 mg兔抗人GBLP多抗加入上清液，4過(guò)夜；加入20 ml充分重懸的蛋白A-瓊脂糖，4 搖動(dòng)3 h，離心，PBS洗滌，棄上清，以20 ml 1×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液重懸，瞬時(shí)高速離心；沸水浴5 min，瞬時(shí)高速離心，上清液于-70保存。上述樣品用于12% SDS-PAGE電泳。1.6 色譜/質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索1.6.1 樣品制備從SDS-PAGE膠上切取目的蛋白條帶，脫色，用25mmol/L NH4HCO3，10mmol/L DTT于57還原1 h；在暗處用25mmol/L NH4HCO3、55mmol/L碘乙酰胺烷基化3

14、0 min。凍干，加入胰酶溶液37過(guò)夜；以50ACN/5 TFA混合液1020 ml萃取，離心5 min；合并萃取液和反應(yīng)液，抽干，加入3 ml 50ACN/5TFA混合液溶解。1.6.2 色譜/質(zhì)譜分析酶解肽混合物用HPLC-CHIP（一支Zorbax 300SB-C18柱 (43 mm×75 mm, 5 mm)和一支 Zorbax 300SB-C18 (40 nL, 5 mm) 富集柱）分級(jí)富集。8 ml樣品上樣到富集柱，富集柱等度運(yùn)行，流動(dòng)相為含0.1%甲酸的超純水，流速：4 mL/min；分離柱梯度運(yùn)行：3%流動(dòng)相B 2min， 55%流動(dòng)相B 17min，75%流動(dòng)相B 2

15、0min，保持5min，流速：0.3 mL（流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B為含0.1%乙腈的甲酸）。在線LC/MSD XCT ion Trap Mass Spectrometer鑒定。HPLC-CHIP/MS以chip cube作為離子源，自動(dòng)定位到納升腔。分離柱分級(jí)后酶解肽直接進(jìn)入質(zhì)譜，毛細(xì)管電壓2000V，干燥氣流速0.32 L/min，干燥氣溫度329 ，質(zhì)量范圍m/z從300到1500。1.6.3 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索Spectrum Mill MS Proteomics Workbench（ Rev A.03.03.078）自動(dòng)分析MS和MS/MS數(shù)據(jù)，搜索UniProt KB/S

16、WISS-PORT、Homo Sapiens(Human)數(shù)據(jù)庫(kù)。搜索條件：胰酶酶解，單同位素，母離子質(zhì)量允差±2.5Da，MS/MS質(zhì)量允差±0.7Da，Carbamidometholation（C）修飾；搜索后自動(dòng)以如下條件驗(yàn)證有效性：蛋白評(píng)分大于11.0，肽評(píng)分大于6.0，%SPI大于60%。2 結(jié)果 2.1 細(xì)胞內(nèi)GBLP的表達(dá)情況及定位2.1.1 WB分析：A泳道GBLP帶的發(fā)光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于B泳道，b-tubulin發(fā)光強(qiáng)度與B泳道無(wú)明顯差異（Fig.1），B泳道中的GBLP比值（A=0.057±0.010）明顯低于A泳道（A=0.098±0.

17、012），經(jīng)t檢驗(yàn)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.011）。即GBLP在經(jīng)S(-)-PRO作用后的HUVEC中的表達(dá)豐度顯著低于R(+)-PRO作用后的表達(dá)，該結(jié)果與前期2-DE結(jié)果一致1。Fig.1 Comparison of GBLP expression abundance in R(+)/S(-)-PRO treated HUVECA: R(+)-PRO treated HUVEC; B: S(-)-PRO treated HUVEC2.1.2 LSCM分析：GBLP在R(+)-PRO作用組（Fig.2-A）的表達(dá)豐度明顯高于S(-)-PRO作用組（Fig.2-B），與前期研究結(jié)果1一致。GB

18、LP主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜（Fig.2），與文獻(xiàn)報(bào)道5一致，GBLP在胞漿中分布均勻，在胞膜上有局部聚集分布現(xiàn)象，尤其是經(jīng)S(-)-PRO作用后（Fig.2-B）。Fig.2 Expression and location of GBLP in R(+)/S(-)-PRO treated HUVEC by LSCMA: R(+)-PRO treated HUVEC; B: S(-)-PRO treated HUVECA2.3 Co-IP所得蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析在對(duì)照組、R(+)-PRO和S(-)-PRO處理組均沉淀出8條蛋白質(zhì)帶，分子量約分別在53 kD、42 kD、40 kD、37

19、kD、35 kD、27 kD、31 kD與20 kD；未加GBLP抗體組無(wú)蛋白質(zhì)條帶沉淀（Fig.3）。Fig.3 SDS-PAGE of proteome required from Co-IPLane A: Marker; B: no GBLP antibody; C: no drug treated group; D: R(+)-PRO treated group; E: S(-)-PRO treated group2.4 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索從SDS-PAGE膠上切取電泳蛋白條帶酶解與質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果顯示，條帶多為含多種蛋白的復(fù)合蛋白條帶。Fig.3中兩條染色極深的條帶主要的蛋

20、白質(zhì)成分為Ig gamma chain C region和Ig Kappa chain V region BS-1，是沉淀用抗體的分解產(chǎn)物，非GBLP相互作用蛋白；其它條帶中鑒定出了7種GBLP相互作用蛋白。從其質(zhì)譜分析所得總離子流圖（Fig.4）中選擇特征肽段進(jìn)行MS/MS分析，并進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索（Table 1）。Fig.4 Total ion chromatography of seven interactional proteins of GBLPTable 1Identification of seven proteins by mass spectrometryNoSpectraDi

21、stinct peptidesMS/MS search score% AAcoverageDatabase AccessionProtein Name12229.913Q02413Desmoglein 1 precursor24464.5726P02662Casein alpha-S1 32227.20827806963Casein alpha-S242120.40883406093Beta casein51120.91474355075Fructose-bisphosphate aldolase C62230.048P06733Alpha enolase73223.9714Q9BG13Per

22、oxiredoxin 2這些蛋白質(zhì)的匹配肽段序列的氨基酸殘基數(shù)均大于15，具有很高的特異性。其中Casein a-S1、Casein a-S2、b casein屬于酪蛋白（casein）家族成員，其余分別為橋粒芯蛋白1前體（Desmoglein 1 precursor，也稱為橋粒芯糖蛋白1，Desmosomal glycoprotein 1，DG1）、a-烯醇化酶（a-enolase，ENO1）、果糖二磷酸醛縮酶C（Fructose-bisphosphate aldolase C，ALDOC）和硫氧還原蛋白過(guò)氧化物酶2（peroxiredoxin 2，Prx 2）。酪蛋白是哺乳動(dòng)物乳汁中的主要

23、蛋白質(zhì)，是主要由乳腺細(xì)胞分泌。目前尚無(wú)HUVEC細(xì)胞分泌酪蛋白的報(bào)道，所以，推測(cè)酪蛋白可能來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)中使用的牛血清，但由于這三個(gè)酪蛋白都與GBLP產(chǎn)生了共沉淀，因此仍將其列為可能的GBLP相互作用蛋白。橋粒是細(xì)胞間重要的連接結(jié)構(gòu)，是維持細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)完整的關(guān)鍵。橋粒芯糖蛋白是構(gòu)成橋粒的主要跨膜蛋白，屬Ca2+依賴性細(xì)胞粘連糖蛋白，介導(dǎo)Ca2+依賴的細(xì)胞粘著和細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)之間的傳遞信號(hào)。分為三種亞型，其中DG1主要分布于表皮細(xì)胞的上部，在多種表皮腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)，DG1可能通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+移動(dòng)信號(hào)的改變，誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+暫時(shí)性增加6。ALDOC主要在腦、心臟、卵巢表達(dá)，是重要

24、的糖酵解酶。糖代謝是能量供應(yīng)的主要途徑，ALDOC催化1,6二磷酸果糖生成磷酸二羥丙酮及3-磷酸甘油醛；ALDOC 是特異而靈敏的心血管疾病標(biāo)志物，可用于評(píng)價(jià)心血管疾病的預(yù)后7, 8。 ENO1催化磷酸甘油向磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化，是糖酵解過(guò)程的限速酶。ENO1一直被認(rèn)為是一個(gè)古老、保守、功能單一的蛋白質(zhì)，但是最近的研究表明，ENO1除了催化糖酵解反應(yīng)，還參與轉(zhuǎn)錄、凋亡的調(diào)控及細(xì)胞分化等過(guò)程。Mizukami等報(bào)道，在心肌缺血時(shí)通過(guò)ERK1/2 調(diào)節(jié)ENO1的表達(dá)，維持心肌細(xì)胞ATP水平，明顯增加細(xì)胞生存能力和增加心肌細(xì)胞收縮力，從而在缺血性損傷中保護(hù)心臟；另外，ENO1可能是一種多功能蛋白質(zhì)，

25、如HSP、c-myc原癌基因的轉(zhuǎn)錄蛋白、細(xì)胞骨架的結(jié)合蛋白、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、纖維蛋白溶酶原，因此還可能具有其他功能9。所以，ENO1在生物學(xué)和病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Prx 2屬于抗氧化蛋白超家族，通過(guò)催化細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫（H2O2）還原，在H2O2介導(dǎo)的多種細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。Prx 2是PDGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)向調(diào)節(jié)劑。PDGF通過(guò)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2調(diào)節(jié)多種信號(hào)蛋白的酪氨酸磷酸化，Prx 2在PDGF刺激下被召募至PDGF受體（PDGFR），抑制內(nèi)源性H2O2產(chǎn)生，從而抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶失活。Prx 2抑制培養(yǎng)細(xì)胞中的PDGFR活性和鼠動(dòng)脈再狹窄模型的PDGFR激活，包

26、括源于血管平滑肌細(xì)胞的PDGF依賴性新生內(nèi)膜增生。Prx 2還與缺血再灌注損傷機(jī)制相關(guān)，保護(hù)細(xì)胞、組織免受活性氧（Reactive oxygen species，ROS）所致?lián)p傷。所以，Prx 2在心血管疾病中具有重要的生物學(xué)功能，但目前尚不清楚Prx 2是如何參與生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的10, 11。上述蛋白中，DG1位于細(xì)胞膜，ALDOC、ENO1、Prx 2位于胞漿，與GBLP的LSCM所觀察到的現(xiàn)象相符。GBLP除已知與PKC結(jié)合外，根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，GBLP還可能通過(guò)與ALDOC、ENO1、Prx 2等蛋白質(zhì)結(jié)合，參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、抗氧化等重要生物學(xué)活動(dòng)，并在心血管疾病的病理生理過(guò)

27、程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能。但鑒于目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，所以，還需要進(jìn)一步開(kāi)展深入研究以明確。3 討論蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化的整體，其功能往往是通過(guò)蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來(lái)的，這種相互作用存在于機(jī)體每個(gè)細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，相互交叉形成網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)成細(xì)胞中一系列重要生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。因此，蛋白質(zhì)相互作用是細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中發(fā)生的最重要和最廣泛的事件，對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用的研究是蛋白質(zhì)組學(xué)最主要研究?jī)?nèi)容之一。免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以在避免人為影響的前提下分

28、離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。其缺點(diǎn)是免疫共沉淀不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物一定是直接相互作用的兩種蛋白，即出現(xiàn)假陽(yáng)性，另外靈敏度不如親和色譜高。為此，本研究選用HPLC-CHIP-IT-MS/MS系統(tǒng)對(duì)相關(guān)的蛋白進(jìn)行鑒定，這是將反相富集色譜柱、反相分析色譜柱、液壓連接以及電噴霧發(fā)射體集成到一個(gè)聚合物芯片上的用于納流電噴霧 LC/MS 的微流控裝置。與傳統(tǒng)的納升液相色譜質(zhì)譜相比，HPLC-CHIP-IT-MS能適應(yīng)極少量樣品的分離分析，能提高蛋白質(zhì)的鑒定能力12。參考文獻(xiàn)1. 毛小琴, 邱峰, 邱宗蔭, et al. 普萘洛爾對(duì)映異構(gòu)體誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異J. 中國(guó)生物化學(xué)

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