Losartan對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板衍化生長(zhǎng)因子及c-myc基因表達(dá)的影響

1、    Losartan對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血小板 衍化生長(zhǎng)因子及c-myc基因表達(dá)的影響        【摘要】目的探討血管緊張素受體拮抗劑-Losartan治療高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的細(xì)胞作用機(jī)制。方法運(yùn)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡定量觀察Losartan作用下的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中細(xì)胞核增殖抗原（PCNA）、PDGF和c-myc原癌基因表達(dá)的平均熒光值。定量研究Losartan對(duì)體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞增殖及血小板生長(zhǎng)因子（PDG

2、F）和c-myc癌基因表達(dá)變化的影響。結(jié)果Losartan作用下，VSMC中的PCNA、和c-myc癌基因的平均熒光值均低于對(duì)照組，而PDGF的平均熒光值與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。結(jié)論Losartan抑制VSMC的增殖及c-myc原癌基因的表達(dá)。該作用與癌基因調(diào)控的蛋白產(chǎn)物作用機(jī)制有關(guān)，是Losartan治療高血壓，參與血管重塑的重要的機(jī)制。【關(guān)鍵詞】平滑肌細(xì)胞增殖Losartan Effect of Losartan on the proliferation of vascular smooth muscle cell and expression of PDGF and c-myc onco

3、geneCHEN Minsheng，LIU Jiankang，HUANG Shaohua.Department of Internal Medicine,Second Affiliated Hospital ,Guangzhou Medical College.【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of Losartan in treating hypertension and atherosclerosis.MethodsThe immunofluorescent quantitative skill and laser scanni

4、ng confocal microscope (ACAS570) were employed to detect changes of the expression of PCNA, PDGF and c-myc in cultured vascular smooth muscle cell effected through the Losartan .ResultsUnder the observation of laser scanning confocal microscope (ACAS570), the fluorescent means of PCNA and c-myc expr

5、ession of VSMC in Losatan group were decreased compared with the control group， but that of PDGF had no changes.ConclusionLosartan possesses inhibitive effects on the proliferation of VSMC and the expression of c-myc oncogene.This effect deals with the molecular mechanism of oncogene regulation.【Key

6、 Words】Smooth muscle cellProliferationLosartan高血壓病是一種以血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)異常增殖為主要病變的疾病，導(dǎo)致VSMC異常增殖的某些致病因素（包括遺傳因素和環(huán)境因素和遺傳以及這兩者之間的相互作用）都與調(diào)控細(xì)胞增殖的癌基因有關(guān)1。洛沙坦(Losartan)是臨床上第一個(gè)用于高血壓治療的非肽類血管緊張素II受體拮抗劑，其藥理及臨床研究表明，Losartan通過特異性地拮抗Ang II受體I亞型舒張血管從而獲得了良好的降壓效果2。但它的降壓作用是否與抑制VSMC增殖、參與血管壁結(jié)構(gòu)的重塑有關(guān)，還有待證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了Losartan對(duì)體外

7、培養(yǎng)VSMC增殖的作用，同時(shí)探討Losartan對(duì)PDGF、c-myc癌基因表達(dá)的影響，旨在證明Losartan的降壓作用與調(diào)控VSMC增殖的癌基因表達(dá)之間的聯(lián)系，并探討該藥的降壓機(jī)制。材料和方法一、血管平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)組織貼塊法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞7。無(wú)菌條件下分離SD大鼠的胸主動(dòng)脈，剪碎后加入適量含10%胎牛血清的DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液，37、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。用光鏡和免疫化學(xué)方法進(jìn)行鑒定。細(xì)胞傳代后選擇生長(zhǎng)良好的第67代VSMC用于實(shí)驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)分組及Losartan條件培養(yǎng)液的配制實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和Losartan組。實(shí)驗(yàn)組加入Losartan條件培養(yǎng)液，對(duì)照組

8、為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液。Losartan (Merck 公司產(chǎn)品)條件培養(yǎng)液以無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液配制，終濃度為10-5g/L。三、Losartan對(duì)VSMC增殖能力和PDGF和c-myc原癌基因表達(dá)的影響選擇第六代生長(zhǎng)良好的平滑肌細(xì)胞，消化傳代至96孔培養(yǎng)板上，傳代細(xì)胞密度為5.0×107/L。細(xì)胞經(jīng)18小時(shí)的預(yù)培養(yǎng)和6小時(shí)的預(yù)處理后，將Losartan條件培養(yǎng)液和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，37、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。吸去培養(yǎng)液，pH 7.3的PBS洗3次，3%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3次。已固定樣品按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法處理。首先，5%正常山羊血清封

9、閉，室溫孵育30分鐘；傾去血清，滴加稀釋度為150鼠抗大鼠細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)、PDGF和c-myc的單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品)，4冰箱過夜。樣品傾去抗體孵育液，PBS洗3次，換加110 FITC熒光標(biāo)記兔抗鼠抗體(天象人公司產(chǎn)品)，室溫孵育40分鐘后，PBS充分洗板，每待測(cè)樣品加入20l PBS后，分別置帶電腦激光掃描共焦顯微細(xì)胞儀(ACAS575UVC型，美國(guó)MERIDIAN公司)下,選用40×物鏡,7%濾光片,確定激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,進(jìn)入Kinetics-Image Scan程序,預(yù)掃描后選定最佳參數(shù),對(duì)選定視野掃描并存儲(chǔ)所獲信息。掃描用于統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、處理細(xì)胞總數(shù)在200個(gè)以上。四、結(jié)果分析進(jìn)入Kinetics-Image Analysis程序，調(diào)出各次實(shí)驗(yàn)存儲(chǔ)信息，分析并作綜合處理并自動(dòng)得出統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，結(jié)果均以±s表示。結(jié)果一、血管平滑肌細(xì)胞鑒定倒置顯微鏡下，細(xì)胞生長(zhǎng)呈典型的“谷與峰”結(jié)構(gòu)特征，a-actin單克隆抗體免疫細(xì)胞化學(xué)顯示95%為陽(yáng)性VSMC。二、Losartan對(duì)VSMC增殖能力和PDGF、c-myc原癌基因表達(dá)的影響將免疫熒光顯示技術(shù)和帶電腦激光掃描共焦顯微細(xì)胞儀的檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)可較為準(zhǔn)確地定量細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的變化，樣品中被檢測(cè)物質(zhì)的多少是以其檢測(cè)物質(zhì)被熒光標(biāo)記的平均熒光值來(lái)表示，見表1。與對(duì)照組相比，Lo

11、sartan組中PCNA和c-myc的平均熒光值均低于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.05)，而PDGF的平均熒光值與對(duì)照組相比則無(wú)明顯差異(P>0.05)。表1兩組各指標(biāo)的熒光值(±s) 組別PCNAPDGFc-myc Losartan1338.56±232.71*828.69±127.54*1528.03±152.14*對(duì)照1542.71±200.04815.28±116.481620.26±174.58與對(duì)照組比，* P<0.05;* P>0.05討論高血壓病的最基本的病理改變是VSMC增殖，并向

12、內(nèi)膜下遷移，以至血管腔增厚狹窄，外周阻力增高。許多促VSMC增殖的生物活性物質(zhì)或致病因素，可通過促細(xì)胞增殖效應(yīng)而引起高血壓。其中癌基因的過度表達(dá)或抑癌基因表達(dá)不足都可能成為高血壓發(fā)病的重要原因。因此，尋找抑制或調(diào)控VSMC增殖的藥物就成為高血壓防治中的重要環(huán)節(jié)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Losartan降壓的同時(shí)，有逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞增生肥大的作用3，這些與抑制VSMC增殖似有關(guān)聯(lián)。因此，探討Losartan對(duì)VSMC增殖的作用以及VSMC增殖所涉及癌基因的表達(dá)，有助于闡明Losartan的降壓作用機(jī)制。我們運(yùn)用免疫熒光顯示技術(shù)和帶電腦激光掃描共聚焦顯微細(xì)胞儀的檢測(cè)技術(shù)，兩者結(jié)合起來(lái)可較為準(zhǔn)確的定量細(xì)胞中核酸和蛋白

13、質(zhì)的變化，該方法是90年代初發(fā)展起來(lái)的一種細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，對(duì)單個(gè)細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的變化可進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果可靠。本實(shí)驗(yàn)Losartan組中， VSMC中PCNA和c-myc癌基因的表達(dá)比對(duì)照組有所降低(P<0.05)，說(shuō)明Losartan對(duì)VSMC的增殖有明顯的抑制作用。PCNA是細(xì)胞核中DNA聚合酶的附屬蛋白，其主要生物學(xué)作用是促進(jìn)細(xì)胞核中DNA鏈的合成與延伸，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖4；而原癌基因c-myc是一種重要的核蛋白調(diào)控基因，與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)5。PCNA和c-myc基因表達(dá)水平的降低說(shuō)明了Losartan可抑制VSMC的增殖。但是，值得注意的是在Losartan

14、 的作用濃度(10-5g/L)低于正常血漿用藥濃度時(shí)，與對(duì)照組相比，VSMC中PDGF和c-myc基因表達(dá)的平均熒光值降低的幅度并不很大，但仍存在差別。這說(shuō)明Losartan對(duì)VSMC增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。PDGF是原癌基因c-sis的表達(dá)產(chǎn)物，其主要的生物學(xué)作用是通過自分泌或旁分泌機(jī)制，促進(jìn)中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜的遷移和增殖6。本實(shí)驗(yàn)中，Losartan對(duì)體外培養(yǎng)VSMC中PCNA和c-myc基因的表達(dá)均具有一定的抑制作用，但對(duì)PDGF的作用卻并不明顯，這與Losartan作用濃度低有關(guān)，還是由于不同濃度的Losartan對(duì)各種癌基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用存在著一定的差異，尚有待進(jìn)一步研究和探討。綜

15、上所述，Losartan作為特異性地拮抗血管緊張素II受體拮抗劑的降壓作用與其對(duì)VSMC增殖的抑制有關(guān)，并涉及癌基因調(diào)控的細(xì)胞及分子機(jī)制。本課題受1998年廣東省自然科學(xué)積極基金資助(980466)作者單位：陳敏生廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科510182劉健康組織胚胎學(xué)教研室黃少華第一附屬醫(yī)院心臟病研究室參考文獻(xiàn)1楊亞東，李倩虹，張新波.原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的研究進(jìn)展.中國(guó)高血壓雜志，1993，1：1-5.2John H, Bauer, Garry PR. The angiotensin II type I receptor antagonists, a new class of antihy

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