幾種魚類血紅蛋白不與人血紅蛋白相互作用及其進化意義

1、幾種魚類血紅蛋白不與人血紅蛋白相互作用及其進化意義         11-01-21 10:07:00     編輯：studa20                   作者：蘇燕 邵國 雎天林 秦文斌  【摘要】  目的：觀察魚類血紅蛋白與人血紅蛋白及其相互之間的相互

2、作用。方法：利用淀粉瓊脂糖混合凝膠交叉電泳的方法。結(jié)果：人血紅蛋白穿過或兜過四種魚類血紅蛋白時并沒有出現(xiàn)通常相互作用（簡稱互作）所觀察到的“峰”或“谷”的改變。結(jié)論：魚類血紅蛋白與人血紅蛋白之間沒有互作，這一結(jié)果對了解血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)及分子進化都具有一定的意義。 【關(guān)鍵詞】  魚類；血紅蛋白；相互作用；進化    Abstract   Objective:To observe the interaction of fish Hb on human Hb. Methods: Agarose-starch mixed gel elect

3、rophoresis was used. Results:There was no "peak-like" or "valley-like" changes appearing while four different kinds of fish Hbs crossing human Hb. Conclusion: No interaction between fish and human Hbs. This will significantly contribute to understanding quarternary structure and

4、molecular evolution of hemoglobin.    Key words  Fish; Hemoglobin; Interaction; Evolution以前，我們利用交叉電泳證明，在紅細胞外，人血紅蛋白2與血紅蛋白可以發(fā)生相互作用1。后來推測，這種相互作用可能是各種血紅蛋白之間的普遍規(guī)律。目前通過實驗已經(jīng)證實哺乳類中的家兔、大小鼠以及幾種鳥類的血紅蛋白均可同人血紅蛋白發(fā)生相互作用25。為了進一步檢驗這種設(shè)想是否正確，我們選擇市場上常見的四種魚類：鯉魚、鯽魚、金魚和泥蚯，用它們的紅細胞制備溶血液，然后與人的紅細胞溶血液進行交叉電泳

5、實驗，觀察它們之間是否發(fā)生相互作用。1  材料與方法1.1  材料硼酸緩沖液（pH9.0），1×TEB緩沖液（pH8.6），氨基黑10B染色液，5%冰醋酸溶液。正常成人血樣來自附屬醫(yī)院血庫，各種魚類血樣來自水產(chǎn)品市場。1.2  方法1.2.1  新鮮魚抗凝血的采集  采用心臟穿刺取血1，肝素抗凝。1.2.2  溶血液制備  取人或魚的抗凝血，離心除去血漿，然后用0.9%生理鹽水（泥蚯用0.7%生理鹽水）洗滌紅細胞34次，最后向紅細胞層加入11.5倍體積蒸餾水及0.5倍體積四氯化碳，激烈振蕩后離心，取上層紅色溶血液備

6、用。1.2.3  電泳分析  利用我室傳統(tǒng)的淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳。加樣方法根據(jù)需要分為兩種：單排加樣，即在板的一端距邊緣1.52cm處或中央并排加樣，使加樣線處于同一水平。雙排加樣，適用于快泳血紅蛋白與相對慢泳血紅蛋白之間的相互作用，具體又分為：穿過實驗：前排（陽極側(cè)）為一條長加樣線，加慢泳血紅蛋白，后排（陰極側(cè)）為一短加樣線，加快泳血紅蛋白，相互拉開一定距離并在兩邊配上不交叉對照樣品;兜過實驗：前排（陽極側(cè)）為一條短加樣線，加慢泳血紅蛋白，后排（陰極側(cè)）為一長加樣線，加快泳血紅蛋白，相互拉開一定距離，并在兩邊配上不交叉對照樣品。1.2.4  染色方法及電泳結(jié)

7、果的保存  將電泳完畢的膠板置于氨基黑10B染色液中染色1h后轉(zhuǎn)入5的冰醋酸中反復(fù)漂洗，直至膠板底色清亮透明，然后取出，觀察結(jié)果、拍照、陰干保存。2  結(jié)果2.1  人血紅蛋白與四種魚類，即鯽魚(Crucian carp)、鯉魚(Common carp)、泥蚯(Loach)及金魚(Goodfish)血紅蛋白電泳位置的相對比較。使用淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳，采用單排加樣法，加樣線位于板中央，樣品均為溶血液，電壓為68V/cm，電泳約34h，電泳結(jié)果見圖1。圖1  人血紅蛋白與四種魚類血紅蛋白電泳位置的相對比較 （略）  由此圖可以看到魚

8、類血紅蛋白與人血紅蛋白相比具有如下特點：（1）四種魚的血紅蛋白組分及電泳行為各不相同，鯉魚具有三種主要的血紅蛋白組分，由陽極側(cè)向陰極側(cè)分別命名為HbC、HbC及HbC。泥蚯有兩種主要的血紅蛋白組分，它們對稱地分別于加樣線的陰陽極兩側(cè)，分別命名為HbP(Positive)和HbN(Nagative)。金魚和鯽魚均只有一個主要的血紅蛋白組分。（2）四種魚的血紅蛋白與人血紅蛋白相比均為相對慢泳血紅蛋白，電泳速度比較為：人HbA>泥蚯HbP >金魚Hb>鯽魚Hb=鯉魚HbC>鯉魚HbC>鯉魚HbC>泥蚯HbN。根據(jù)上述特點我們便可以選用適當(dāng)?shù)慕徊骐娪痉椒▉矸治龈鞣N血

9、紅蛋白間的相互作用。2.2  魚類血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用2.2.1  鯉魚血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用  分別采用雙排穿過和兜過實驗，讓快泳人血紅蛋白穿過或兜過相對慢泳鯉魚血紅蛋白。電壓為68V/cm通電約5h左右，結(jié)果見圖2。圖2  鯉魚血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用（略）    由上述兩圖可見，人血紅蛋白在穿過和兜過鯉魚血紅蛋白后，區(qū)帶位置及形狀均未發(fā)生變化，說明兩者之間可能沒有發(fā)生相互作用。2.2.2  泥蚯血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用  分別采用雙排穿過和兜過實驗，加樣

10、線位于板中央，讓快泳人血紅蛋白穿過或兜過相對慢泳泥鰍血紅蛋白。電壓為68V/cm通電約5h左右，結(jié)果見圖3。     11-01-21 10:07:00     編輯：studa20圖3  泥蚯血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用（略）   可見，人血紅蛋白在穿過和兜過泥蚯的兩個血紅蛋白組分后，二者的血紅蛋白電泳區(qū)帶與對照相比均未發(fā)生改變，說明兩者之間可能未發(fā)生相互作用。2.2.3  鯽魚血紅蛋白與人血紅蛋白間的相互作用  分別采用雙排穿過和兜過實驗，讓快泳

11、人血紅蛋白穿過或兜過相對慢泳鯽魚血紅蛋白。電壓為68V/cm通電約5h左右，結(jié)果見圖4。圖4  鯽魚血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用（略）   由以上兩圖可知，人血紅蛋白在穿過和兜過鯽魚血紅蛋白后，二者的血紅蛋白電泳區(qū)帶與對照相比均未發(fā)生改變，說明人血紅蛋白與鯽魚血紅蛋白之間可能也不存在相互作用。2.2.4  金魚血紅蛋白與人血紅蛋白間的相互作用  分別采用雙排穿過和兜過實驗，讓快泳人血紅蛋白穿過或兜過相對慢泳金魚血紅蛋白，結(jié)果見圖5。圖5  金魚血紅蛋白與人血紅蛋白之間的相互作用（略）   

12、由以上兩圖可知，人血紅蛋白在穿過和兜過金魚血紅蛋白后，二者的血紅蛋白電泳區(qū)帶與對照相比均未發(fā)生改變，說明金魚血紅蛋白與人血紅蛋白之間可能也不存在相互作用。3  討論    在我們以前的實驗中，已經(jīng)明確證明，在電場中人血紅蛋白A和A2可以發(fā)生相互作用，很可能是一種“一過性對稱雜交”1。在此基礎(chǔ)上，我們又發(fā)現(xiàn)人血紅蛋白與一些哺乳動物如大小鼠、家兔等血紅蛋白之間也有這種相互作用2-4。因此，我們曾設(shè)想，這種相互作用也許是各種血紅蛋白間相互作用的普遍規(guī)律。但在按照原來計劃進行魚類血紅蛋白與人血紅蛋白相互作用的實驗時，出現(xiàn)了與過去設(shè)想迥然不同的情況。在完全相同的實

13、驗條件下，同時比較研究了鳥類血紅蛋白或魚類血紅蛋白與人血紅蛋白的相互作用。實驗結(jié)果表明，魚類血紅蛋白與人血紅蛋白在相互穿過時均未出現(xiàn)以前見到的互作所特有的“波浪形區(qū)帶”，說明兩者之間可能沒有發(fā)生相互作用。一系列實驗和多次重復(fù)的結(jié)果，都一再證明二者在相互作用方面存在明顯差異5。此項結(jié)果不支持作者以前關(guān)于“各種血紅蛋白間都可能發(fā)生相互作用，即血紅蛋白互作的普遍性”的設(shè)想，從而提出不同種類動物間血紅蛋白相互作用可以有差異。在這種情況下，我們有可能提出一個血紅蛋白分子進化方面的新問題。    過去談血紅蛋白的分子進化，多數(shù)是講各種血紅蛋白在氨基酸序列方面的同源性。進化過程

14、相近者，同源性較大等。這些都屬于一級結(jié)構(gòu)或者化學(xué)結(jié)構(gòu)范疇?，F(xiàn)在，我們是從立體結(jié)構(gòu)方面，特別是從相互作用、交換二聚體、一過性對稱雜交方面進行比較研究，并且發(fā)現(xiàn)哺乳類、鳥類血紅蛋白與魚類血紅蛋白之間存在區(qū)別。    現(xiàn)在可以認為，在生物進化過程中，特別是脊椎動物的進化過程中，鳥類和魚類之間在血紅蛋白分子進化方面存在一定的差異。我們的研究還在進行，初步實驗證明，這個差異可能還要再深入到兩棲類與爬行類之間。因此，我們推斷，血紅蛋白的互作可能在羊膜動物和非羊膜動物之間存在分水嶺，這將給血紅蛋白分子進化提供新的知識。【參考文獻】  1 秦文斌.紅細胞外血紅蛋白與血紅蛋白2之間的相互作用J.生物化學(xué)雜志，1991,7(5):583-585.2 秦良誼,秦文斌.幾種哺乳動物血紅蛋白與