發(fā)酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的測定研究_圖文

1、發(fā)酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素 和大豆抗原的測定研究彭輝才1粱明振1張宏福2(1廣西大學(xué)動物科技學(xué)院,廣西南寧530005;2北京畜牧獸醫(yī)研究所營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室, 北京海淀區(qū)100094摘要:豆粕中最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本試驗對8種發(fā)酵豆 粕進(jìn)行測定,前兩者含量極低未檢出。用SDS-PAGE凝膠電泳定性檢測大豆抗原中的B一伴大豆球蛋 白(B-Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6種條帶模糊,抗原消失,結(jié)果表明,生物發(fā)酵是 一種有效的鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法。關(guān)健詞:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白測定發(fā)酵豆粕指是

2、通過現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)對原料豆粕進(jìn)行發(fā)酵處理后的產(chǎn)物。發(fā)酵過程中可產(chǎn)生蛋 白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多種酶活,其目的就是消除抗?fàn)I養(yǎng)因子,把大分子量的大豆蛋白質(zhì) 分解為多肽、寡肽、小肽,從而增加水溶性,提高消化率,利于動物消化吸收。這些酶把纖維類物 質(zhì)分解為糖,部分糖被轉(zhuǎn)化為乳酸,并產(chǎn)生大量有益微生物,使豆粕轉(zhuǎn)化成高營養(yǎng)價值的功能性飼 料。發(fā)酵豆柏可替代日糧中血漿蛋白粉、魚粉、腸膜蛋白和乳清粉等動物性飼料原料,可替代日糧 中控制腹瀉的預(yù)防性抗生素,大大降低生產(chǎn)成本,減少畜禽養(yǎng)殖對動物性飼料原料的依賴,杜絕動 物性飼料原料所帶來的疾病傳播,提高養(yǎng)殖業(yè)的安全與效益。大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子有蛋白酶抑制因子(

3、protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、 非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、單寧、大豆寡糖、脲酶、.大豆異黃酮、大豆皂甙、致甲 狀腺腫因子、生氰糖甙等。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會導(dǎo)致人和動物胰腺腫大、過敏反應(yīng)、生長緩慢、日糧 養(yǎng)分利用率下降以及其他一些不良生理反應(yīng)。本試驗測定起主要抗?fàn)I養(yǎng)作用的胰蛋白酶抑制因子、 凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。1材料與方法1.1腮酶的測定脲酶活性測定參照國標(biāo)GB8622-88執(zhí)行。1.2胰蛋白酶抑制因子(TI的測定方法發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的測定,參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1103.2-20

4、06, 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測抗?fàn)I養(yǎng)素第2部分:胰蛋白酶抑制劑的測定。其原理是,胰蛋白 酶可作用于底物苯甲酰一L-精氨酸對硝基苯胺(隊PA結(jié)構(gòu)中精氨酸與對硝基苯胺的連接鍵,釋放出 黃色的對硝基苯胺,該物質(zhì)在410hm有最大吸收值。大豆及其產(chǎn)品中的胰蛋白酶抑制劑可抑制這一反應(yīng),使吸光度 值下降,其下降程度與胰蛋白酶抑制劑活性成正比。用分光光度法在410hm處測定吸光度值的變化, 可對胰蛋白酶抑制劑活性進(jìn)行定量分析。1.3凝集素的測定方法發(fā)酵豆粕凝集素的測定,參照戴大章<飼料中植物凝集素的快速檢測方法>中的方法進(jìn)行,其原 理是,凝集素具有凝集兔、人等的紅細(xì)胞的能力,細(xì)胞凝集作用

5、是凝集索與細(xì)胞表面的糖分子結(jié)合 在細(xì)胞表面形成許多交叉的“橋”的結(jié)果。凝集活力(效價與凝集素的量成線性關(guān)系。因此,利用 凝血反應(yīng)測定其血凝活力,通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的血凝活力,可以定量檢測凝集素含量。 1.4B一伴大豆球蛋白(BCongIycinin和大豆球蛋白(Glycinin測定方法B-Conglycinin,目前多數(shù)人認(rèn)為這是相對分子量為180kDa的三聚體,是7S的主要組分,由 三個亞基(a 7、0、B組成?？捎肧DS-PAGE凝膠電泳使其變性,從而將其單體亞基分開。大豆球 蛋白(Glycinin,是純化的11S大豆球蛋白,目前認(rèn)為其是相對分子量為360kDa的六聚體,其單聚 體亞

6、基的結(jié)構(gòu)為A-S-S-B,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,S-S為二硫鍵,將A和B連接起來。 B一巰基乙醇(B一臟等還原劑可將Glycinin的亞基和多肽分開幢1。測定這兩者的方法是,用 Tris-HCl提取,然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker,定性檢驗其在發(fā)酵豆粕中 存在的情況。1.4.1抗原蛋白抽提稱取過60目的發(fā)酵豆粕1.OOg,向其中加入20.OmlO.03mol/L的Tris-HCl(pH8.0,包括 0.Olmol/L B一疏基乙醇,在室溫下于搖床上(100r/min浸提1h,然后在10000r/min、20條 件下離心20min后,取上清液。此上清液為

7、11S與7S的球蛋白混合液。1.4.2試劑配制丙烯酰胺30%單體貯液:稱取丙烯酰胺29.19,甲叉雙丙烯酰胺0.99,于250mi燒杯中,向燒 杯中加入約80ml滅菌去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙?加滅菌去離子水將溶液定容至lOOml,棕色瓶4度 冰箱保存。分離膠緩沖液貯液1.5M Tris-Hcl(pH8.8:稱量18.169Tris置于250Inl燒杯中,加入滅菌水 約80ml,充分?jǐn)嚢枞芙?用6M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8,將溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。濃縮膠緩沖液貯液1.OM Tris-Hcl(pH6.8:稱量12.129Tris置于250mi燒杯中,加入約80ml 滅菌水充分?jǐn)嚢枞芙?用

8、6M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8,將溶液定容至毫100m1.4度冰箱保存IO%SDS溶液:稱量lOg SDS置于200ml燒杯中,加入lOOml滅菌水溶解,室溫保存。10%過硫酸銨:稱取lg過硫酸銨,加入9mi去離子水后攪拌溶解,貯存于4度冰箱中。5*Tris-Glycine Buffer(電極緩沖液:稱量下列試劑于1L燒杯中:Tris 15.19,Glycine(甘 氨酸949,SDS 5.Og;加入約800ml去離子水,攪拌溶解,加去離子水將溶液定容至lL,室溫保 存。樣品緩沖液(0.踟Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl濃縮膠緩沖液貯液(1.伽Tris-Hcl,pH6.8,4ml IO

9、%SDS,Iml 8一巰基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚藍(lán),轉(zhuǎn)移到20ML容量瓶,加去離子水定容到刻度。 染色液:稱取0.59考馬斯亮蘭P,250,加125mi異丙醇溶解,加50ml冰醋酸攪拌均勻,再加325mi去離子水?dāng)嚢?然后用快謎定性濾紙過濾.室溫保存。脫色液:取50ml冰醋酸,25ral無水乙醇,42鈿1去離子永,混合均勻,室溫保存。I t3不連墟￥OS-P性黜電泳的濃縮腔和分離腔的材取按下表比例配制分離腔與濃縮膠表l 1羈升高睨和鼴濃縮膠配制144電泳將提取液與樣品緩沖液以i:l的比例混臺后,在100度水浴鍋中煮5min取30u1,點樣到制作 好的電泳板上。雖白質(zhì)Marker的用

10、量參照其說明書.內(nèi)外均加一樣的電極緩沖瘦,開始以80V電 壓電泳,持溴酚藍(lán)條帶進(jìn)入分離脞后,加大電壓到120V,溴酚藍(lán)到底部上約050I處結(jié)柬電泳。 145染色、脫色和照相將電泳后的膠板移染液中.在轉(zhuǎn)速為40一60r/rain的搖床上染色2h后,轉(zhuǎn)到脫色液中浸泡過 夜,期間更換2-3狄脫色藏,至電林條帶清晰為止。用數(shù)碼相機拍攝凝膠照片,記錄井保存。2結(jié)果與分析2I量活性8種發(fā)酵豆粕的腮薛活性均為0。22胰蛋白一抑崩囚于和疆墓素用上述方法測定了8種發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制園子及凝集素,古量糧低.均未檢出23大豆抗原用8種發(fā)酵豆粕和一種普通豆粕.做了電泳,圖片如下:其中條帶5是普通豆粕,9是蛋白質(zhì)分子

11、量標(biāo)準(zhǔn)(Marker,其余是發(fā)酵豆粕,標(biāo)準(zhǔn)物分子量條帶如圖 標(biāo)注所示,在一定條件下,蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率問的關(guān)系,可用下式表示:MW=K(10一hlgl哪=lgKbnh=KIbml式中:唧為蛋白質(zhì)的分子量:K,K。為常數(shù);b為斜率;咖為相對遷移率測量標(biāo)準(zhǔn)物各條帶到加樣口的距離,而得到分子量與遷移率的相關(guān)方程為:y=一1.3275x+2.5002(r=0.99,從而算出7S和1IS的幾個亞基的分子量如下表2,同樣也把 Maruyama(1998和李德發(fā)(2003所研究的幾個亞基的分子量列在表中,用以對照。表2五個亞基的分子量表從圖上可見,1、3、4、6、7、8號樣品,幾個亞基消失,說明大豆

12、抗原已經(jīng)完全分解,2號和10號 樣品,兩種抗原的條帶清楚,說明抗原存在,發(fā)酵不徹底。3討論3.1腮酶活性(UA尿酶活性測定值是傳統(tǒng)的用以鑒定豆柏加熱程度的指標(biāo)。尿酶本身無營養(yǎng)意義,但它與胰蛋白酶 抑制因子的含量接近,而且遇熱變性失活的程度與胰蛋白酶抑制因子相似。在一定范圍內(nèi),脲酶活 性與胰蛋白酶抑制因子的含量具有強相關(guān)性,測定脲酶活性可以間接地反映胰蛋白酶抑制因子的含 量。但尿酶沒有負(fù)值.它對任何過熟豆粕的最低值均顯示為零,而此時胰蛋白酶抑制因子未必為零, 因此測定脲酶活性是不夠的,還需要測定胰蛋白酶抑制因子才行。3.2發(fā)酵豆粕胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量在一定的范圍內(nèi),隨著大豆中抗?fàn)I養(yǎng)因子的

13、受熱鈍化。大豆的營養(yǎng)價值得到改善。在大豆抗?fàn)I 養(yǎng)因子中,胰蛋白酶抑制因子、脲酶和大豆凝集素是熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子,對熱比較敏感。常壓蒸汽 處理,溫度不超過100,蒸汽加熱30min,胰蛋白酶抑制因子活性可降低90%。Oin(1996報道, 當(dāng)生大豆通入蒸汽,120加熱7.5min時,胰蛋白酶抑制因子的含量可由20.6mg/g下降到3.3mg/g¨1。 秦貴信(1995報道,常壓蒸汽102,20min,胰蛋白酶抑制因子下降88%,而40min則下降92%, 60min,全部消失哺1。與胰蛋白酶抑制因子相比,大豆凝集素對高溫更為敏感,這是由于大豆凝集素是一種糖蛋白, 具有不可逆轉(zhuǎn)變性特點,較

14、容易失活。Qin(1996報道¨1,102"C加熱20min,大豆凝集素的存留率只 有1.4%,當(dāng)溫度提高到。提高到120,只要1.5min就完全失去活性.采用濕熱處理,190"C加熱 1060秒就可以完全失活。于平等(2001m1報道,濕熱處理,加熱到80.凝集素活性無明顯變化,7595加熱25min才開始明顯下降,95加熱35min或120加熱15min,其活性可以完全喪失。 目前發(fā)酵豆粕是用固體發(fā)酵方法生產(chǎn),其生產(chǎn)工藝流程是:豆粕加水拌勻、蒸煮、接種、發(fā)酵、 后熟干燥、磨粉、包裝。其中蒸煮滅菌是,在常壓下、溫度100左右,進(jìn)行蒸煮約30min,這可以 使絕大

15、部分胰蛋白酶抑制因子和凝集素失去活性。胰蛋白酶抑制因子本身是一種蛋白質(zhì),可以被蛋白酶水解成更簡單的多肽,活性隨著酶解反應(yīng) 的進(jìn)行,而逐步喪失。Laskowski等(1974盯1發(fā)現(xiàn),胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶能特異性地將KTI水 解成多肽,降低其活性。楊曉泉呻1等(2001研究發(fā)現(xiàn),在一定條件下,堿性內(nèi)切蛋白酶(alcalase 可同時降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制因子,其中胰蛋白酶抑制因子可被鈍化8096。Huo等舊1(1993用 五種來源于細(xì)菌和真菌的蛋白酶進(jìn)行了生大豆(RS和低溫膨化全脂大豆粉(LTES中的胰蛋白酶抑制 因子和凝集素的體外鈍化試驗,結(jié)果表明,它們都不同程度地鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子,其中

16、一種來源于細(xì) 菌的蛋白酶分別鈍化生大豆中62%的胰蛋白酶抑制因子和91%的糜蛋白酶抑制因子(CIA。由此可見,發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中,消除抗?fàn)I養(yǎng)因子源于兩個方面,一是蒸煮過程,二是發(fā)酵過 程。蒸煮滅菌后,值入的菌體一般是乳酸,酵母、芽孢桿菌屬、曲霉菌屬等,會分泌許多酶作用于 抗?fàn)I養(yǎng)因子,從而降低其活性。這兩方面共同作用,導(dǎo)致發(fā)酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子和凝集素 被分解和鈍化,含量極低或被完全分解,從而檢不出。3.3大豆抗原含量到20世紀(jì)末期,人們已認(rèn)識到日糧抗原過敏反應(yīng)是斷奶后腹瀉的先決條件,因此大豆抗原是 否已經(jīng)分解,是決定發(fā)酵豆粕質(zhì)量的是一個重要的指標(biāo)。Maruyama等(1998,研究認(rèn)為B

17、一伴大豆 球蛋白是一種三聚體蛋白質(zhì),分子量范圍為150200kDa,由三種亞基組成:a("-71kDa,a (-一67kDa, 和8(-50kDa,所有的亞基都是N一糖基化的。由對照樣品普通豆粕分子量和遷移率 方程可計算出,其三個亞基Q。、Q、B的分子量分別是72.3、68.6,52.7kDa,與Maruyama研究 結(jié)果很相近。大豆球蛋白(Glycinin,是純化的11S大豆球蛋白,目前認(rèn)為其是相對分子量為360kDa的六聚 體,其單聚體亞基的結(jié)構(gòu)為AS-sB,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,分別為3444kDa和 20kDa,S-s為二硫鍵,將A和B連接起來心1。也從上述方程中

18、可知,普通豆粕的A、B亞基的分子量 分別是38.4kDa和20.4kDa,也與這結(jié)果相近。在8種發(fā)酵豆粕的圖譜中,我們可以看出2號樣品有B一伴大豆球蛋白中的Q 7a兩個亞基存在, 8號樣品有B亞基存在,10號樣品有大豆球蛋白的A、B亞基,其它樣品均無這兩種抗原的亞基, 也即均已在發(fā)酵中分解為多肽或更小分子量的肽。也說明發(fā)酵,能在一定程度上分解了大豆抗原。 可以嘗試在斷奶仔豬飼料中多使用發(fā)酵豆柏。3.4抗?fàn)I養(yǎng)因子測定種類的確定各種抗?fàn)I養(yǎng)因子在大豆中的含量各不相同,且抗?fàn)I養(yǎng)作用興有差異?？傮w上看,大豆蛋白酶抑 制因子、凝集素和植酸等的抗?fàn)I養(yǎng)作用較強,而抗維生素因子和皂甙等的抗?fàn)I養(yǎng)作用較弱.有些甚

19、至沒有抗?fàn)I養(yǎng)作用,而主要作為生物活性物質(zhì)。蛋白酶抑制因子,主要指Kunitz(庫尼茲胰蛋白 酶抑制因子(KTI和鮑曼一伯g蛋白酶抑制因子(Bolmmn-Birk,BBI,前者主要在大豆中,而后者 主要在豌豆和菜豆中。Liener(1996研究報道¨硼,在生大豆對大鼠生長抑制作用方面,大豆凝集素76的貢獻(xiàn)率為，胰蛋白酶抑制因子（）為，而其它抑制因子僅為。大量的研究表明，斷 奶仔豬飼糧中的抗原引起腸道的短暫過敏反應(yīng)是斷奶后腹瀉的決定因素。大豆中存在的抗原物質(zhì)能 引起仔豬腸道過敏和損傷，進(jìn)而引起腹瀉。已證實，引起斷奶仔豬過敏反應(yīng)的主要抗原是大豆球蛋 白和一伴大豆球蛋白。由此可見。只需測定這三者即可。其他的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低，不構(gòu)成抗?fàn)I 養(yǎng)作用，不必測定。 小結(jié)和展望 大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子中胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原，抗?fàn)I養(yǎng)作用最強，在抑制動物生長 中，凝集素貢