血小板衍生生長因子對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原的影響

1、血小板衍生生長因子對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原的影響【摘要】目的探討血小板衍生生長因子(PDGF-AB)促進(jìn)傷口愈合的作用機(jī)理及其在瘢痕增生中的作用。方法取體外培養(yǎng)的人正常皮膚及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，用原位雜交法觀察PDGF對(duì)兩種細(xì)胞表達(dá)Pro 1()mRNA的影響。結(jié)果PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞表達(dá)Pro 1()mRNA均有明顯促進(jìn)作用，且均呈劑量依賴性關(guān)系，但作用有差異。結(jié)論P(yáng)DGF-AB可能通過刺激成纖維細(xì)胞合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)傷口愈合，同時(shí)也可導(dǎo)致膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而促進(jìn)瘢痕增生?！娟P(guān)鍵詞】血小板衍生生長因子成纖維細(xì)胞原位雜交瘢痕The effects of PDGF-AB o

2、n Pro 1() mRNA expression of fibroblastsDONG Maolong,CHEN Bi,XU Mingda,et al.(Department of Burn Surgery Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710032，PR China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of PDGF-AB to promote wound healing and its role during the process of scar

3、 formation.MethodsIn vitro cultured fibroblasts of human normal skin and hypertrophic scar were treated with PDGF-AB.The expression of Pro 1() mRNA of the fibroblasts was evaluated by in situ hybridization technique.ResultsPDGF-AB could increase Pro 1()mRNA expression of fibroblasts of both normal s

4、kin and hypertrophic scar in a dose-dependent manner.However,the effect of PDGF-AB on hypertrophic scar fibroblasts was stronger.ConclusionsPDGF-AB may promote wound healing by stimulating extracelluar matrix synthesis,e.g.collagen.PDGF-AB may also play a role in scar formation through collagen depo

5、sition.【Key words】PDGF-AB；Fibroblast；In situ hybridization;Scar創(chuàng)面愈合包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化、移行、血管神經(jīng)再生，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重建，以及后期的收縮與瘢痕形成等一系列過程。成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過程中擔(dān)任主要角色，通過遷移、分化、分裂、增殖、分泌膠原、蛋白糖苷、纖維粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成份的途徑參與創(chuàng)面愈合。同時(shí)，創(chuàng)面愈合過程又受到許多生長因子的調(diào)控，血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是創(chuàng)面愈合過程中較早出現(xiàn)且起重要作用的生長因子1。我們以體外培養(yǎng)的人正常皮膚和增生

6、性瘢痕成纖維細(xì)胞(normal skin fibroblast,NsFb；hypertrophic scar fibroblast,HTsFb)為模型，研究PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞表達(dá)膠原Pro 1() mRNA的差異，探討PDGF-AB在創(chuàng)面愈合及瘢痕形成中的作用機(jī)理，為PDGF-AB的合理臨床應(yīng)用，提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1藥品和試劑PDGF-AB購于Sigma公司。DMEM為Gibco公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Dibco公司產(chǎn)品，新生小牛血清為上海產(chǎn)。小鼠抗人-SMattin抗體購于武漢博士德生物技術(shù)公司。1.2成纖維細(xì)胞培養(yǎng)取術(shù)中多余的人正常皮膚及手術(shù)切除的增生性瘢痕，2.

7、5ml/L洗必泰浸泡5min，生理鹽水漂洗3次，剪成約1mm3大小，用組織塊法培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37、5% CO2，每隔3d換液一次，待細(xì)胞融合后，用0.125%胰酶+0.01%EDTA消化傳代，取第36代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3PDGF-AB對(duì)成纖維細(xì)胞的作用取對(duì)數(shù)生長期的NsFb和HTsFb，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/ml，35mm，培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)置無菌蓋玻片(26mm21mm)，每張蓋玻片上接種0.5ml細(xì)胞懸液，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6h后，換成含不同濃度PDGF-AB的2%FCS DMEM，設(shè)置0，12.5，50ng/ml PDGF-AB 3個(gè)濃度組，繼續(xù)培養(yǎng)48h

8、后，棄去培養(yǎng)基，0.01mol/L PBS清洗帶有細(xì)胞的蓋玻片3次，然后用10%多聚甲醛4固定24h，自然干燥后原位雜交分析。1.4人Pro 1()型cDNA探針購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動(dòng)與職業(yè)病研究所，長度為4.5kb，編碼人Pro 1()肽鍵的全部核苷酸序列，載體為bluescript,重組位點(diǎn)為Ecor I。1.5探針標(biāo)記按德國寶靈曼DIG-DNA標(biāo)記和檢測試劑盒說明進(jìn)行，此法為隨機(jī)引物法。1.6mRNA原位雜交參照文獻(xiàn)2進(jìn)行。1.7Pro 1() mRNA陽性染色半定量分析應(yīng)用CMIAS系列彩色像分析系統(tǒng)對(duì)Pro 1 () mRNA染色玻片進(jìn)行像分析，將玻片置于像分析系統(tǒng)的顯微鏡載物臺(tái)

9、上，在相同放大倍率(200)下，通過攝像機(jī)攝取像于熒光屏，由鼠標(biāo)器在同一灰度值下選取10個(gè)細(xì)胞，將之提取并輸入像分析儀，經(jīng)主機(jī)對(duì)陽性物質(zhì)面積和灰度進(jìn)行測定和顯示。每張玻片測3個(gè)視野，對(duì)平均灰度值(MG)進(jìn)行F檢驗(yàn)，比較不同PDGF-AB濃度組間的差異。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室開發(fā)的SPLM統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)。2結(jié)果PDGF-AB促進(jìn)兩種成纖維細(xì)胞Pro 1() mRNA的表達(dá)，且均呈PDGF-AB劑量依賴性關(guān)系；在相同濃度時(shí)，PDGF-AB對(duì)HTsFb Pro 1() mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用比NsFb強(qiáng)(表1)。3討論在人體正常皮膚中，主要有型膠原和型膠原，型

10、膠原量大，起支架作用，與型膠原含量比為101。在創(chuàng)面愈合的過程中，成纖維細(xì)胞被激活，合成和分泌膠原，主要以型為主，另有少量的I型膠原。在正常傷口愈合后期，膠原的合成與分解漸趨平衡，膠原纖維排列亦趨規(guī)則，在增生瘢痕組織中，型膠原比例明顯上升，、型膠原比例達(dá)到313。表1PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞的表達(dá)Pro 1() mRNA的影響(n=18,s)Tab 1 The effect of PDGF-AB on Pro 1() mRNA expression in fibroblasts(n=18,s)組別PDGF-AB濃度(ng/ml)012.550.0NsFb(MG)16.490.5732.0

11、41.0742.611.07HTsFb(MG)22.011.4047.001.0355.760.51與比較：P0.01；與比較：P0.01；與比較：P0.01；與比較：P0.01 我們用原位雜交法測定PDGF-AB對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)Pro 1() mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明：瘢痕成纖維細(xì)胞較正常皮膚成纖維細(xì)胞有更強(qiáng)的合成膠原能力。PDGF-AB促進(jìn)兩種成纖維細(xì)胞Pro 1 () mRNA的表達(dá)，且均呈PDGF-AB劑量依賴性關(guān)系。PDGF-AB對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞Pro 1 () mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用比對(duì)正常成纖維細(xì)胞強(qiáng)。結(jié)果證實(shí)PDGF-AB促進(jìn)膠原的合成主要發(fā)生在

12、轉(zhuǎn)錄水平，與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，可能在瘢痕增生中起重要作用，這與臨床上正常皮膚及增生性瘢痕的病理學(xué)、組織學(xué)特征相符合。Grotendors GR,Mavy JA認(rèn)為纖維組織增生性疾病與傷口愈合的過程類似，是一種過度愈合，其中一個(gè)重要的因素就是PDGF等生長因子的作用。PDGF在正常傷口愈合過程中存在時(shí)間較短，而在纖維組織增生性疾病中長期存在，反復(fù)作用，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞過度增生、結(jié)締組織過度形成4，5。Yi-ES將PDGF-AB經(jīng)氣管直接注射到鼠肺組織中導(dǎo)致肺間質(zhì)細(xì)胞的增生和纖維化形成6。Plemon-SJM發(fā)現(xiàn)牙齦過度增生中PDGF及其受體表達(dá)量顯著增高7，在Dupnytre

13、n掌攣縮癥及許多增生性疾病中均見到PDGF及其受體含量的增高8，9。我們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上證實(shí)PDGF-AB對(duì)成纖維細(xì)胞Pro 1()合成的促進(jìn)作用，但膠原的合成與降解是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，包括蛋白質(zhì)的翻譯，翻譯后的修飾，其中還包括許多氧化酶、蛋白酶、膠原酶、以及金屬蛋白酶抑制劑的參與10，PDGF-AB可能在多個(gè)環(huán)節(jié)上調(diào)節(jié)膠原的合成與分解，從而參與創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的過程。作者單位：董茂龍(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安，710032)陳璧(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安，710032)徐明達(dá)(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安，710032)蘇映軍(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安，71003

14、2)湯朝武(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安，710032)參考文獻(xiàn)1，Thomas FD,Rodney SK.Growth factors and wound healing:platelet-derived growth factor as a model cytokine.Ann Rev Med,1991,42:367-384.2，蔡文琴.DNA及寡聚核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用.見：蔡文琴，王伯云主編.實(shí)用免疫細(xì)胞學(xué)與核酸分子雜交技術(shù).成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994：417-418.3，Zhang K,Warren G,Leslie C,et al.Increased ty

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