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文檔簡介

1、血小板衍生生長因子對(duì)成纖維細(xì)胞合成膠原的影響【摘要】目的探討血小板衍生生長因子(PDGF-AB)促進(jìn)傷口愈合的作用機(jī)理及其在瘢痕增生中的作用。方法取體外培養(yǎng)的人正常皮膚及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞,用原位雜交法觀察PDGF對(duì)兩種細(xì)胞表達(dá)Pro 1()mRNA的影響。結(jié)果PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞表達(dá)Pro 1()mRNA均有明顯促進(jìn)作用,且均呈劑量依賴性關(guān)系,但作用有差異。結(jié)論P(yáng)DGF-AB可能通過刺激成纖維細(xì)胞合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)傷口愈合,同時(shí)也可導(dǎo)致膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,從而促進(jìn)瘢痕增生?!娟P(guān)鍵詞】血小板衍生生長因子成纖維細(xì)胞原位雜交瘢痕The effects of PDGF-AB o

2、n Pro 1() mRNA expression of fibroblastsDONG Maolong,CHEN Bi,XU Mingda,et al.(Department of Burn Surgery Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xian 710032,PR China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of PDGF-AB to promote wound healing and its role during the process of scar

3、 formation.MethodsIn vitro cultured fibroblasts of human normal skin and hypertrophic scar were treated with PDGF-AB.The expression of Pro 1() mRNA of the fibroblasts was evaluated by in situ hybridization technique.ResultsPDGF-AB could increase Pro 1()mRNA expression of fibroblasts of both normal s

4、kin and hypertrophic scar in a dose-dependent manner.However,the effect of PDGF-AB on hypertrophic scar fibroblasts was stronger.ConclusionsPDGF-AB may promote wound healing by stimulating extracelluar matrix synthesis,e.g.collagen.PDGF-AB may also play a role in scar formation through collagen depo

5、sition.【Key words】PDGF-AB;Fibroblast;In situ hybridization;Scar創(chuàng)面愈合包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化、移行、血管神經(jīng)再生,細(xì)胞外基質(zhì)的合成與重建,以及后期的收縮與瘢痕形成等一系列過程。成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過程中擔(dān)任主要角色,通過遷移、分化、分裂、增殖、分泌膠原、蛋白糖苷、纖維粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成份的途徑參與創(chuàng)面愈合。同時(shí),創(chuàng)面愈合過程又受到許多生長因子的調(diào)控,血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是創(chuàng)面愈合過程中較早出現(xiàn)且起重要作用的生長因子1。我們以體外培養(yǎng)的人正常皮膚和增生

6、性瘢痕成纖維細(xì)胞(normal skin fibroblast,NsFb;hypertrophic scar fibroblast,HTsFb)為模型,研究PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞表達(dá)膠原Pro 1() mRNA的差異,探討PDGF-AB在創(chuàng)面愈合及瘢痕形成中的作用機(jī)理,為PDGF-AB的合理臨床應(yīng)用,提供一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1藥品和試劑PDGF-AB購于Sigma公司。DMEM為Gibco公司產(chǎn)品,胰蛋白酶為Dibco公司產(chǎn)品,新生小牛血清為上海產(chǎn)。小鼠抗人-SMattin抗體購于武漢博士德生物技術(shù)公司。1.2成纖維細(xì)胞培養(yǎng)取術(shù)中多余的人正常皮膚及手術(shù)切除的增生性瘢痕,2.

7、5ml/L洗必泰浸泡5min,生理鹽水漂洗3次,剪成約1mm3大小,用組織塊法培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,培養(yǎng)條件為37、5% CO2,每隔3d換液一次,待細(xì)胞融合后,用0.125%胰酶+0.01%EDTA消化傳代,取第36代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.3PDGF-AB對(duì)成纖維細(xì)胞的作用取對(duì)數(shù)生長期的NsFb和HTsFb,調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/ml,35mm,培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)置無菌蓋玻片(26mm21mm),每張蓋玻片上接種0.5ml細(xì)胞懸液,加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6h后,換成含不同濃度PDGF-AB的2%FCS DMEM,設(shè)置0,12.5,50ng/ml PDGF-AB 3個(gè)濃度組,繼續(xù)培養(yǎng)48h

8、后,棄去培養(yǎng)基,0.01mol/L PBS清洗帶有細(xì)胞的蓋玻片3次,然后用10%多聚甲醛4固定24h,自然干燥后原位雜交分析。1.4人Pro 1()型cDNA探針購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動(dòng)與職業(yè)病研究所,長度為4.5kb,編碼人Pro 1()肽鍵的全部核苷酸序列,載體為bluescript,重組位點(diǎn)為Ecor I。1.5探針標(biāo)記按德國寶靈曼DIG-DNA標(biāo)記和檢測試劑盒說明進(jìn)行,此法為隨機(jī)引物法。1.6mRNA原位雜交參照文獻(xiàn)2進(jìn)行。1.7Pro 1() mRNA陽性染色半定量分析應(yīng)用CMIAS系列彩色像分析系統(tǒng)對(duì)Pro 1 () mRNA染色玻片進(jìn)行像分析,將玻片置于像分析系統(tǒng)的顯微鏡載物臺(tái)

9、上,在相同放大倍率(200)下,通過攝像機(jī)攝取像于熒光屏,由鼠標(biāo)器在同一灰度值下選取10個(gè)細(xì)胞,將之提取并輸入像分析儀,經(jīng)主機(jī)對(duì)陽性物質(zhì)面積和灰度進(jìn)行測定和顯示。每張玻片測3個(gè)視野,對(duì)平均灰度值(MG)進(jìn)行F檢驗(yàn),比較不同PDGF-AB濃度組間的差異。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室開發(fā)的SPLM統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)。2結(jié)果PDGF-AB促進(jìn)兩種成纖維細(xì)胞Pro 1() mRNA的表達(dá),且均呈PDGF-AB劑量依賴性關(guān)系;在相同濃度時(shí),PDGF-AB對(duì)HTsFb Pro 1() mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用比NsFb強(qiáng)(表1)。3討論在人體正常皮膚中,主要有型膠原和型膠原,型

10、膠原量大,起支架作用,與型膠原含量比為101。在創(chuàng)面愈合的過程中,成纖維細(xì)胞被激活,合成和分泌膠原,主要以型為主,另有少量的I型膠原。在正常傷口愈合后期,膠原的合成與分解漸趨平衡,膠原纖維排列亦趨規(guī)則,在增生瘢痕組織中,型膠原比例明顯上升,、型膠原比例達(dá)到313。表1PDGF-AB對(duì)兩種成纖維細(xì)胞的表達(dá)Pro 1() mRNA的影響(n=18,s)Tab 1 The effect of PDGF-AB on Pro 1() mRNA expression in fibroblasts(n=18,s)組別PDGF-AB濃度(ng/ml)012.550.0NsFb(MG)16.490.5732.0

11、41.0742.611.07HTsFb(MG)22.011.4047.001.0355.760.51與比較:P0.01;與比較:P0.01;與比較:P0.01;與比較:P0.01 我們用原位雜交法測定PDGF-AB對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)Pro 1() mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果表明:瘢痕成纖維細(xì)胞較正常皮膚成纖維細(xì)胞有更強(qiáng)的合成膠原能力。PDGF-AB促進(jìn)兩種成纖維細(xì)胞Pro 1 () mRNA的表達(dá),且均呈PDGF-AB劑量依賴性關(guān)系。PDGF-AB對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞Pro 1 () mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用比對(duì)正常成纖維細(xì)胞強(qiáng)。結(jié)果證實(shí)PDGF-AB促進(jìn)膠原的合成主要發(fā)生在

12、轉(zhuǎn)錄水平,與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比,有更強(qiáng)的促進(jìn)作用,可能在瘢痕增生中起重要作用,這與臨床上正常皮膚及增生性瘢痕的病理學(xué)、組織學(xué)特征相符合。Grotendors GR,Mavy JA認(rèn)為纖維組織增生性疾病與傷口愈合的過程類似,是一種過度愈合,其中一個(gè)重要的因素就是PDGF等生長因子的作用。PDGF在正常傷口愈合過程中存在時(shí)間較短,而在纖維組織增生性疾病中長期存在,反復(fù)作用,導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞過度增生、結(jié)締組織過度形成4,5。Yi-ES將PDGF-AB經(jīng)氣管直接注射到鼠肺組織中導(dǎo)致肺間質(zhì)細(xì)胞的增生和纖維化形成6。Plemon-SJM發(fā)現(xiàn)牙齦過度增生中PDGF及其受體表達(dá)量顯著增高7,在Dupnytre

13、n掌攣縮癥及許多增生性疾病中均見到PDGF及其受體含量的增高8,9。我們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上證實(shí)PDGF-AB對(duì)成纖維細(xì)胞Pro 1()合成的促進(jìn)作用,但膠原的合成與降解是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程,包括蛋白質(zhì)的翻譯,翻譯后的修飾,其中還包括許多氧化酶、蛋白酶、膠原酶、以及金屬蛋白酶抑制劑的參與10,PDGF-AB可能在多個(gè)環(huán)節(jié)上調(diào)節(jié)膠原的合成與分解,從而參與創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的過程。作者單位:董茂龍(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安,710032)陳璧(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安,710032)徐明達(dá)(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安,710032)蘇映軍(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安,71003

14、2)湯朝武(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷外科西安,710032)參考文獻(xiàn)1,Thomas FD,Rodney SK.Growth factors and wound healing:platelet-derived growth factor as a model cytokine.Ann Rev Med,1991,42:367-384.2,蔡文琴.DNA及寡聚核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用.見:蔡文琴,王伯云主編.實(shí)用免疫細(xì)胞學(xué)與核酸分子雜交技術(shù).成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社,1994:417-418.3,Zhang K,Warren G,Leslie C,et al.Increased ty

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