MSI診斷檢測的方法和應(yīng)用

1、MSI診斷檢測的方法和應(yīng)用診斷檢測的方法和應(yīng)用主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容 微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)背景微衛(wèi)星不穩(wěn)定的相關(guān)背景MSI的檢測意義的檢測意義MSI檢測方法檢測方法MSI檢測試劑盒檢測試劑盒背背 景景 介介 紹紹 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, (microsatellite instability, MSI)MSI)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。新的微衛(wèi)星等

2、位基因現(xiàn)象。 主要機(jī)制：主要機(jī)制： DNADNA多聚酶的滑動導(dǎo)致重復(fù)序列中多聚酶的滑動導(dǎo)致重復(fù)序列中1 1個或多個堿基的個或多個堿基的錯配錯配 MSMS同源重組導(dǎo)致堿基對的丟失和插入同源重組導(dǎo)致堿基對的丟失和插入 19931993年，年，AltonenAltonen等首次發(fā)現(xiàn)，在等首次發(fā)現(xiàn)，在HNPCCHNPCC細(xì)胞中存在高頻率細(xì)胞中存在高頻率的的MSIMSI。目前已發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)MSIMSI的腫瘤主要有的腫瘤主要有3 3類：類： 一類為一類為HNPCCHNPCC病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及卵巢病人發(fā)生的結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及卵巢癌癌, ,這一類腫瘤幾乎都表現(xiàn)為這一類腫瘤幾乎都表現(xiàn)為

3、MSIMSI； 另一類為散發(fā)性結(jié)直腸癌另一類為散發(fā)性結(jié)直腸癌, ,這一類腫瘤發(fā)生這一類腫瘤發(fā)生MSIMSI概率約概率約15 30； 第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內(nèi)的其它腫瘤, ,這這一類腫瘤一類腫瘤MSIMSI發(fā)生頻率相對較低。發(fā)生頻率相對較低。背背 景景 介介 紹紹結(jié)直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每結(jié)直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每年有年有1313萬萬-16-16萬人罹患結(jié)直腸癌，其發(fā)病率占腫瘤萬人罹患結(jié)直腸癌，其發(fā)病率占腫瘤發(fā)病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌。發(fā)病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌。 HNPCCHNPCC是常見的遺傳性

4、腫瘤綜合癥，遺傳性結(jié)是常見的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結(jié)直腸癌是一個常染色體遺傳疾病直腸癌是一個常染色體遺傳疾病, ,目前研究表明微目前研究表明微衛(wèi)星不穩(wěn)定性可能是遺傳性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要衛(wèi)星不穩(wěn)定性可能是遺傳性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。機(jī)制。背背 景景 介介 紹紹具有具有MSI的散發(fā)性結(jié)直腸癌的散發(fā)性結(jié)直腸癌,具有不同的臨床病理、具有不同的臨床病理、分子生物學(xué)特征分子生物學(xué)特征,表現(xiàn)為表現(xiàn)為:發(fā)病年齡較?。粚δ承┗煱l(fā)病年齡較?。粚δ承┗熕幬锼幬?如如5-FU、順鉑等、順鉑等)有原發(fā)性耐藥有原發(fā)性耐藥; 生物學(xué)行為較生物學(xué)行為較好。好。MSI-H是是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標(biāo)志物，也期結(jié)腸癌預(yù)后

5、良好的一個標(biāo)志物，也是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預(yù)測指標(biāo)。測指標(biāo)。背背 景景 介介 紹紹微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義1. 1. 檢測檢測MSIMSI可以用于檢測是否為可以用于檢測是否為LynchLynch綜合征綜合征結(jié)直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性結(jié)直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性綜合征，例如綜合征，例如LynchLynch綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌，性結(jié)直腸癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉?。ǎ┖图易逍韵⑷獠。‵APFAP）。在）。在HNPCC

6、 HNPCC 和散發(fā)性直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遍布整和散發(fā)性直腸癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遍布整個基因組的現(xiàn)象，并且可能是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的普遍機(jī)個基因組的現(xiàn)象，并且可能是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的普遍機(jī)制。制。 專家組推薦，專家組推薦， MMRMMR蛋白檢測應(yīng)強(qiáng)烈建議在所蛋白檢測應(yīng)強(qiáng)烈建議在所有有5050歲以下的結(jié)腸癌患者中開展，原因在于該歲以下的結(jié)腸癌患者中開展，原因在于該群體中患群體中患LynchLynch綜合征的可能性增加。而且，在綜合征的可能性增加。而且，在一些中心，現(xiàn)在對所有的結(jié)直腸腫瘤組織進(jìn)行一些中心，現(xiàn)在對所有的結(jié)直腸腫瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測（有時分析免疫組化檢測（有時分析MSIMSI）以來決定

7、哪些患）以來決定哪些患者需要進(jìn)行者需要進(jìn)行LynchLynch綜合征相關(guān)的基因檢測綜合征相關(guān)的基因檢測. .微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義義 2. 檢測檢測MSI可以用于判斷患者預(yù)后可以用于判斷患者預(yù)后高危高危期患者，定義為預(yù)后較差者，包括：期患者，定義為預(yù)后較差者，包括：T4（B、C期）、組織學(xué)分化差（期）、組織學(xué)分化差（3/4級，不包級，不包括括MSI-H者），已經(jīng)有大量證據(jù)表明者），已經(jīng)有大量證據(jù)表明MMR蛋白蛋白表達(dá)缺失或表達(dá)缺失或MSI-H是是期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個期結(jié)腸癌預(yù)后良好的一個標(biāo)志物。具有標(biāo)志物。具有MSI-H腫瘤的腫瘤的期結(jié)腸癌患者，期結(jié)腸癌患者，3/4級分化

8、（低分化）不再認(rèn)為是高危因素。級分化（低分化）不再認(rèn)為是高危因素。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義3. 3. 檢測檢測MSIMSI以判斷是否需要輔助化療以判斷是否需要輔助化療對于對于期結(jié)腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決期結(jié)腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決策時需要考量的一個重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定策時需要考量的一個重要信息就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（性（MSIMSI）。）。研究認(rèn)為研究認(rèn)為MMR MMR 基因?yàn)榛驗(yàn)镸SI-HMSI-H（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）（高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定）會對順鉑、卡培他濱及會對順鉑、卡培他濱及5-FU 5-FU 產(chǎn)生耐藥性，相反產(chǎn)生耐藥性，相反MSI-LMSI-L、MS

9、S MSS 的患者不會產(chǎn)生耐藥。的患者不會產(chǎn)生耐藥。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義 一項研究長期隨訪了一項研究長期隨訪了/期結(jié)腸癌期結(jié)腸癌患者后發(fā)現(xiàn)，患者后發(fā)現(xiàn)，MSI-LMSI-L或或MSSMSS者通過者通過5-FU5-FU輔助輔助化療確實(shí)改善了預(yù)后；然而，化療確實(shí)改善了預(yù)后；然而，MSI-HMSI-H者卻者卻不能從術(shù)后不能從術(shù)后5-FU5-FU輔助化療中顯著獲益，與輔助化療中顯著獲益，與單純手術(shù)相比，單純手術(shù)相比，5-5-年生存率反而更低。年生存率反而更低。微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的意義MSI 檢檢 測測 方方 法法1. 免疫組化方法免疫組化方法(IHC) 免疫

10、組化方法僅用于與腫瘤細(xì)胞中的免疫組化方法僅用于與腫瘤細(xì)胞中的MLH1, MSH2, MSH6和和PMS2蛋白結(jié)蛋白結(jié)合。如果沒有結(jié)合任何的蛋白，就證明發(fā)生了合。如果沒有結(jié)合任何的蛋白，就證明發(fā)生了MSI。2. 直接測序法直接測序法 對對MMR基因各區(qū)域（基因各區(qū)域（MLH1、MSH2、MSH6等）的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。等）的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。3. 多重?zé)晒舛嘀責(zé)晒釶CR 采用多重?zé)晒獠捎枚嘀責(zé)晒釶CR的方法對的方法對NCI建議的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，以確定建議的位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，以確定MSI狀態(tài)。狀態(tài)。檢檢 測測 MSI 方方 法法 比比 較較 方法方法靈敏度靈敏度特異特異性性重現(xiàn)重現(xiàn)性性時間時間成本成本操

11、作操作IHC90%低低低低3-5天天5001000復(fù)雜復(fù)雜直接測序直接測序法法80100%高高高高5-7天天10002000 簡便簡便多重?zé)晒舛嘀責(zé)晒釶CR100%高高高高2-3天天5001000 簡便簡便Microread MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 閱微基因根據(jù)閱微基因根據(jù)NCCNNCCN指南，針對結(jié)直腸癌基因診斷領(lǐng)域研發(fā)了指南，針對結(jié)直腸癌基因診斷領(lǐng)域研發(fā)了MSIMSI檢測檢測的試劑盒。的試劑盒。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定（微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）檢測試劑盒）檢測試劑盒是一款以多重

12、熒光是一款以多重?zé)晒釶CRPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的基因突變檢測系統(tǒng)，一次擴(kuò)增檢技術(shù)為基礎(chǔ)的基因突變檢測系統(tǒng)，一次擴(kuò)增檢測測6 6個個MSIMSI位點(diǎn)，操作簡便、快速。位點(diǎn)，操作簡便、快速。擴(kuò)擴(kuò) 增增 檢檢 測測 位位 點(diǎn)點(diǎn)位點(diǎn)位點(diǎn)GenBankNumber重復(fù)序列重復(fù)序列產(chǎn)物范圍產(chǎn)物范圍1標(biāo)記熒光類型標(biāo)記熒光類型NR-27AF070674(A)2770-91HEXNR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007

13、684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMRMSI 檢檢 測測 送送 樣樣 要要 求求 若客戶提供石蠟切片，則要求厚度若客戶提供石蠟切片，則要求厚度5-20m的石蠟切片（切片的石蠟切片（切片中確保含有中確保含有9mm2以上大小的組織塊）以上大小的組織塊）10片或以上，注明石蠟片或以上，注明石蠟包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。若客戶提供若客戶提供DNA樣品，則從新鮮組織

14、提取的樣品，則從新鮮組織提取的DNA最佳，最佳，20ng/l以上的以上的DNA 20l即可（需提供即可（需提供DNA濃度）；若為石蠟濃度）；若為石蠟包埋組織提取的包埋組織提取的DNA，除了提供，除了提供DNA的濃度（的濃度（20ng/l以上的以上的DNA至少至少20l）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 使使 用用 方方 法法 DNA提取：根據(jù)樣本不同，采用二甲苯或提?。焊鶕?jù)樣本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取的方法提取DNA； PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增： 毛細(xì)管電泳檢測：按照毛細(xì)管電泳檢測：按照（）（）樣品數(shù)樣品數(shù)+（甲酰胺

15、）（甲酰胺）樣品數(shù)樣品數(shù)制備制備好樣品，好樣品，RUN 3130 xl遺傳分析儀。遺傳分析儀。組分組分20 l體系體系(l)Master Mix無核酸酶超純水無核酸酶超純水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合引物混合物物4.0模板模板DNA2.0反應(yīng)總體積反應(yīng)總體積20.0操操 作作 流流 程程 示示 意意 圖圖數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 分分 析析n 目的峰：目的峰：A. 單核苷酸標(biāo)記的位點(diǎn)單核苷酸標(biāo)記的位點(diǎn)NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖2； 圖圖2 單核苷酸標(biāo)記位點(diǎn)峰型示意圖單核苷酸標(biāo)記位點(diǎn)峰型

16、示意圖B. 五核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)五核苷酸重復(fù)的位點(diǎn)Penta C、Penta D和性別位點(diǎn)和性別位點(diǎn)Amelogenin的峰型均為單峰型，見圖的峰型均為單峰型，見圖3。 圖圖3 五核苷酸標(biāo)記和性別位點(diǎn)峰型示意圖五核苷酸標(biāo)記和性別位點(diǎn)峰型示意圖n 非目的峰：非目的峰：pull-up峰、峰、stutter峰、染料峰、加峰、染料峰、加A不完全峰等。不完全峰等。數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 分分 析析MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-H型 根據(jù)根據(jù)NCI建議，與正常樣本比較，有建議，與正常樣本比較，有2個發(fā)生改變可稱定為個發(fā)生改變可稱定為MSI-H型，型，只有只有1個出現(xiàn)不穩(wěn)定的為個出現(xiàn)不穩(wěn)定的為MSI-

17、L型，沒有出現(xiàn)突變的情況為型，沒有出現(xiàn)突變的情況為MSS型。型。微衛(wèi)星不穩(wěn)定MSI-L型MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS型MSI 判判 定定 結(jié)結(jié) 果果MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 基于基于MSIMSI的的NCI panelNCI panel標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)了適合中國人群的標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)了適合中國人群的MSIMSI檢測系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)； 采用多重?zé)晒獠捎枚嘀責(zé)晒釶CRPCR技術(shù)，一次擴(kuò)增和檢測技術(shù)，一次擴(kuò)增和檢測6 6個準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸個準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸微衛(wèi)星基因座，其中微衛(wèi)星基因座，其中5 5個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合中國人

18、群的位點(diǎn)；中國人群的位點(diǎn)； 基于測序儀的基因分型研究領(lǐng)域擁有多年的經(jīng)驗(yàn)和多項成果，基于測序儀的基因分型研究領(lǐng)域擁有多年的經(jīng)驗(yàn)和多項成果，已經(jīng)做了超過已經(jīng)做了超過10001000例病例樣本，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。例病例樣本，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。MSI 檢檢 測測 案案 例例XBH-XXBH-1* 接收委托方兩份樣本，正常組織接收委托方兩份樣本，正常組織XBH-X和腫瘤組織和腫瘤組織XBH-1，要求鑒定腫瘤組織的，要求鑒定腫瘤組織的MSI狀態(tài)，狀態(tài)，正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和和MONO-27等等5個位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰。該腫瘤組織為個位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰。該腫瘤組織為MSI-H型。型。13MS6E13MS6C* 接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織13MS6C和正常組織和正常組織13MS6E，要求檢測該腫瘤組，要求檢測該腫瘤組織的織的MSI狀態(tài)，狀態(tài)，6個單核苷酸位點(diǎn)均未出現(xiàn)個單核苷酸位點(diǎn)均未出現(xiàn)MSI，鑒定結(jié)果為，鑒定結(jié)果為MSS穩(wěn)定狀態(tài)。穩(wěn)定狀態(tài)。MSI 檢檢 測測 案案 例例閱閱 微微 基基 因