細(xì)胞培養(yǎng)污染簡介

1、細(xì)胞培養(yǎng)中污染物的預(yù)防與清除細(xì)胞培養(yǎng)中污染物的預(yù)防與清除丁小燕丁小燕中科院上海生化細(xì)胞所2016，Jan，22-24中國科學(xué)院生物中國科學(xué)院生物 遺傳資源評價與組學(xué)應(yīng)用技術(shù)遺傳資源評價與組學(xué)應(yīng)用技術(shù) 培訓(xùn)班培訓(xùn)班培訓(xùn)班目的：提高各生物資源保藏庫在資源保藏、評提高各生物資源保藏庫在資源保藏、評價方面的科技創(chuàng)新與服務(wù)能力。價方面的科技創(chuàng)新與服務(wù)能力。資源保藏、評價資源保藏、評價創(chuàng)新能力創(chuàng)新能力服務(wù)能力服務(wù)能力（科學(xué)院對我們的要求） 十八大明確提出要十八大明確提出要“實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略，強(qiáng)調(diào)科技創(chuàng)新是實(shí)施創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略，強(qiáng)調(diào)科技創(chuàng)新是提高社會生產(chǎn)力和綜合國力的戰(zhàn)略支撐，必須擺在國家發(fā)展全局提高社

2、會生產(chǎn)力和綜合國力的戰(zhàn)略支撐，必須擺在國家發(fā)展全局的核心位置的核心位置”。 我國科技服務(wù)業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎(chǔ)，但是與英、美等發(fā)我國科技服務(wù)業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎(chǔ)，但是與英、美等發(fā)達(dá)國家相比，我國的科技服務(wù)業(yè)產(chǎn)值及其占達(dá)國家相比，我國的科技服務(wù)業(yè)產(chǎn)值及其占GDPGDP比重較低，比重較低，20112011年度實(shí)現(xiàn)科技服務(wù)增加值不足年度實(shí)現(xiàn)科技服務(wù)增加值不足70007000億元，占億元，占GDPGDP比重約為比重約為1.4%1.4%。 2014 2014年年1010月，國務(wù)院印發(fā)月，國務(wù)院印發(fā)關(guān)于加快科技服務(wù)業(yè)發(fā)展的若干意關(guān)于加快科技服務(wù)業(yè)發(fā)展的若干意見見（國發(fā)（國發(fā)201420144949號

3、），這是國務(wù)院號），這是國務(wù)院首次首次對對科技服務(wù)業(yè)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展發(fā)展作出的全面部署。作出的全面部署。 用創(chuàng)新驅(qū)動科技服務(wù)業(yè)的發(fā)展用創(chuàng)新驅(qū)動科技服務(wù)業(yè)的發(fā)展（國家對我們的要求）細(xì)胞資源為生物醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐和保障細(xì)胞資源保藏和技術(shù)研發(fā)細(xì)胞資源保藏和技術(shù)研發(fā) 人類遺傳資源庫基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)細(xì)胞庫國家發(fā)展和安全戰(zhàn)略一， 細(xì)胞系是重要的遺傳資源。細(xì)胞庫的功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手，也是推動細(xì)胞庫向科技服務(wù)業(yè)轉(zhuǎn)移重心的必經(jīng)之路。二， 保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫保藏能力的關(guān)鍵性標(biāo)志，也是其他能力提升的基礎(chǔ)。一， 細(xì)胞系是重要

4、的遺傳資源。由細(xì)胞庫（Cell Bank）負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系。細(xì)胞庫細(xì)胞庫技技術(shù)術(shù)咨咨詢詢對對外外供供應(yīng)應(yīng)鑒鑒定定檢檢測測 文文檔檔管管理理 細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng) 質(zhì)質(zhì)量量控控制制保藏、評價保藏、評價開放、共享開放、共享技技術(shù)術(shù)服服務(wù)務(wù)培培訓(xùn)訓(xùn)科科普普一， 細(xì)胞系是重要的遺傳資源。負(fù)責(zé)保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫應(yīng)當(dāng)開發(fā)、承擔(dān)更多的功能，提升服務(wù)科技、服務(wù)社會的能力，產(chǎn)生更高的服務(wù)業(yè)產(chǎn)值。細(xì)胞庫細(xì)胞庫技技術(shù)術(shù)咨咨詢詢對對外外供供應(yīng)應(yīng)鑒鑒定定檢檢測測 文文檔檔管管理理 細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng) 質(zhì)質(zhì)量量控控制制保藏、評價保藏、評價開放、共享開放、共享技技術(shù)術(shù)服服務(wù)務(wù)培培訓(xùn)訓(xùn)科科普普拓寬收集渠道拓寬收集渠道提升保藏特色提升

5、保藏特色瞄準(zhǔn)科技發(fā)展前沿瞄準(zhǔn)科技發(fā)展前沿提升利用開發(fā)水平提升利用開發(fā)水平一， 細(xì)胞系是重要的遺傳資源。保存細(xì)胞系的細(xì)胞庫其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細(xì)胞保藏單位的關(guān)鍵抓手。中科院細(xì)胞庫堅持國際接軌的細(xì)胞保藏技術(shù)水平，積極吸引國內(nèi)有知識產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞系進(jìn)入細(xì)胞庫保藏，逐步形成自己的特色。堅持用戶至上的服務(wù)態(tài)度，全方位為用戶著想為用戶服務(wù)，積極推動庫內(nèi)細(xì)胞資源的利用。密切關(guān)注國際細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展前沿，主動與醫(yī)院等單位合作，拓寬細(xì)胞資源的種類，為我國細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展做好準(zhǔn)備。我們的目標(biāo)二，污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵。保證細(xì)胞株不受污染是細(xì)胞庫保藏能力的關(guān)鍵性

6、標(biāo)志，也是其他能力提升的基礎(chǔ) 1，細(xì)菌污染 2，真菌污染 3，支原體污染 4，內(nèi)毒素污染 5，細(xì)胞間交叉污染1 1，細(xì)菌污染。，細(xì)菌污染。 實(shí)驗(yàn)室中因操作不慎而引起的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了預(yù)防劑量的抗菌素也會產(chǎn)生。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成實(shí)驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。2 2，真菌污染，真菌污染 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中較為常見，尤其在南方霉雨季

7、節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易產(chǎn)生。最常見的真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色小點(diǎn)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。3 3，支原體污染，支原體污染3.13.1，支原體污染是目前實(shí)驗(yàn)室中最為常見的污染細(xì)胞的原核生物。，支原體污染是目前實(shí)驗(yàn)室中最為常見的污染細(xì)胞的原核生物。 因支原體屬于直徑介于0.2左右的最小原核生物，形態(tài)易變，故極易通過濾膜而逃過培養(yǎng)液的過濾除菌步驟。在細(xì)胞培養(yǎng)液中，支原體可達(dá)到107-108CFU/

8、mL （CFU=Colony Forming Unit，支原體濃度測量單位）而不使培養(yǎng)液混濁及影響細(xì)胞生長。多種支原體對細(xì)胞不產(chǎn)生任何病變效應(yīng)，使得細(xì)胞污染不易被察覺。據(jù)報道，目前世界上有30-50%的細(xì)胞株已受支原體污染。但是支原體對干細(xì)胞培養(yǎng)的影響甚大，胚胎干細(xì)胞受支原體污染形態(tài)、生長速度等均出現(xiàn)改變。 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時候，即應(yīng)懷疑支原體污染。 由于多數(shù)細(xì)胞受支原體污染后無明顯變化或略有變化，若不及時處理，將產(chǎn)生交叉污染。另外，支原體會改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征，因此盡管很多受支原體污染的細(xì)胞其形態(tài)看不出變化，但對

9、其進(jìn)行進(jìn)一步分子生物學(xué)分析時，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果會不準(zhǔn)確。為此建議各實(shí)驗(yàn)室定期對細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查。 可污染細(xì)胞的支原體種類較多，主要有Mycoplasma orale, M.hyorhinis, M.arginini 和 Acholeplasma laidlawii。目前已發(fā)現(xiàn)的支原體超過100種，這就是單一的檢測方法有時會失敗的原因之一。我們建議至少選擇2種方法來檢測支原體。3.23.2，常用支原體檢測方法，常用支原體檢測方法.1，肉湯培養(yǎng)基檢測法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。，肉湯培養(yǎng)基檢測法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。.2，間接染色法檢測支原體，間接染色法檢測支原體用待檢測的細(xì)胞

10、培液培養(yǎng)Vero細(xì)胞，然后用顯微鏡觀察是否有支原體感染。Vero細(xì)胞來源于正常的成年非洲綠猴腎組織，由Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年在日本Chiba大學(xué)分離得到。Vero細(xì)胞是非整倍體，可在培養(yǎng)液中無限生長，常用來生產(chǎn)疫苗，檢測支原體和細(xì)菌外毒素等。細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體可用Hoechst33258或DAPI染色后觀察到。由于支原體含有DNA，染色后在細(xì)胞表面，培養(yǎng)基中及培養(yǎng)皿表面呈現(xiàn)出熒光小點(diǎn)。Vero細(xì)胞DAPI染色熒光照片(400)。A，感染支原體的Vero細(xì)胞。藍(lán)色卵圓形熒光物質(zhì)為Vero細(xì)胞核，其周圍藍(lán)色熒光小點(diǎn)為支原體(箭頭)；B，未感染支原體的陰性對照V

11、ero細(xì)胞；C，加入待檢培養(yǎng)液的Vero細(xì)胞(未感染支原體)。ABC間接染色法檢測支原體間接染色法檢測支原體.2，PCRPCR法檢測支原體法檢測支原體 許多支原體檢測方法不僅用時長而且復(fù)雜，有的方法僅限于檢測有限種類的支原體。PCR檢測法靈敏度高，特異性強(qiáng)，只用一天時間即可快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的支原體，是一種檢測支原體的有效手段。中科院干細(xì)胞庫選擇支原體16S rDNA序列為靶序列設(shè)計引物，同時做對照組實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)以避免假陽性或假陰性結(jié)果，取得了很好的效果。PCR法支原體檢測電泳圖。+： 陽性對照； -：陰性對照；1：送檢樣品1（感染支原體）；2：送檢樣品2（未感染支原體）；

12、3：樣品1的干擾實(shí)驗(yàn)；4： 樣品2的干擾實(shí)驗(yàn)。若在270bp處有條帶，檢測結(jié)果為陽性。陽性對照及干擾實(shí)驗(yàn)PCR產(chǎn)物在270bp處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確可靠。600bp400bp500bp200bp300bp100bpMarker + - 1 2 3 4PCRPCR法檢測支原體法檢測支原體 預(yù)防：預(yù)防：1.支原體噴霧（品牌：Biochrom )：噴于操作臺和培養(yǎng)箱2.Plasmocin prophylactic （品牌：InvivoGen）：作用濃度為 5g/ml 作用于常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基（ 500 x 稀釋） 去除：去除：Plasmocin treatment（品牌：Invi

13、voGen）：作用濃度為 25g/ml ，作用于感染的培養(yǎng)細(xì)胞基兩周（ 1000 x 稀釋）。3.33.3，支原體污染的預(yù)防和去除，支原體污染的預(yù)防和去除 4.14.1， 細(xì)菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)物的危害：細(xì)菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)物的危害：實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)細(xì)胞（尤其是ES細(xì)胞）的生長及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時間、劑量依賴性。 4.2 4.2，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源：，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源：細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份-牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內(nèi)毒素的潛在來源。我國2000年版中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中對牛血清提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包括蛋白質(zhì)含量，細(xì)菌、真菌、支原體

14、、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素，支持細(xì)胞增殖檢查等等。對于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)，LIF和bFGF是細(xì)菌內(nèi)毒素的另一個潛在來源。 4 4，內(nèi)毒素污染，內(nèi)毒素污染 4.34.3，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的監(jiān)控：，細(xì)胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的監(jiān)控：為排除血清、LIF和bFGF中內(nèi)毒素的污染，細(xì)菌內(nèi)毒素檢測是非常重要的。中國科學(xué)院干細(xì)胞庫只使用細(xì)菌內(nèi)毒素小于1EU/ml的血清、LIF和bFGF等各種生長因子。4.44.4，內(nèi)毒素監(jiān)控是細(xì)胞用于臨床治療所必須的。，內(nèi)毒素監(jiān)控是細(xì)胞用于臨床治療所必須的。 目前各類臨床級干細(xì)胞尚無統(tǒng)一的國際、國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，這是胚胎干細(xì)胞進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段的最大障礙之一，也是細(xì)胞庫水平的一個重要標(biāo)志

15、。但是在制藥工業(yè)中內(nèi)毒素是必須去除的。因此，中國科學(xué)院干細(xì)胞庫強(qiáng)調(diào)高標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)要求，把內(nèi)毒素監(jiān)控作為細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。鱟試劑凝膠半定量法檢測（參考2010年版中國藥典）4.54.5，內(nèi)毒素檢測方法，內(nèi)毒素檢測方法鱟試劑：鱟科動物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme）和凝固蛋白原（Coagulogen）。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據(jù)反應(yīng)所形成凝膠的程度來檢測樣品內(nèi)內(nèi)毒素的含量。5 5，細(xì)胞間交叉污染，細(xì)胞間交叉污染Hel

16、a細(xì)胞是第一株源細(xì)胞系。1952年建系以來，現(xiàn)在世界上已建有幾千株細(xì)胞系，為我們的生物醫(yī)藥事業(yè)提供研究材料。但是隨之而來的細(xì)胞間交叉污染以及細(xì)胞系錯認(rèn)現(xiàn)象必須得到重視。 細(xì)胞間交叉污染細(xì)胞間交叉污染/databases/cross-contaminations(International Cell Line Authentication Committee, ICLAC)超過400種細(xì)胞系已被鑒定為錯認(rèn)的細(xì)胞系防止細(xì)胞交叉污染防止細(xì)胞交叉污染（1 1）在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，）在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別

17、。并嚴(yán)格按順序進(jìn)行操作，避免一起最好做上標(biāo)記便于辨別。并嚴(yán)格按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行操作時易發(fā)生混亂。進(jìn)行操作時易發(fā)生混亂。（2 2）在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)）在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。（3 3）所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均）所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早應(yīng)及早留種凍存留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之，重新復(fù)蘇留種細(xì)胞，一旦發(fā)生污染可棄之，重新復(fù)蘇留種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)。 每一株細(xì)胞都有獨(dú)特的來源。因此，對于有疑問的的細(xì)胞株，可進(jìn)行同工酶或STRSTR(short tandem repeat，短片段重復(fù)序列)檢測進(jìn)行身份鑒定。STRSTR廣泛存在于人類及哺乳動物的基因組中，具有高度多態(tài)性，它們一般由2-6個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復(fù)排列，由核心序列重復(fù)數(shù)目的變化產(chǎn)生長度多態(tài)性。對于一個特定的個體，染色體上某個特定位置的重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)是