蛋白質(zhì)的提取純化和分析

1、蛋白質(zhì)的提取純化和分析1 1題目解析已知某蛋白的分子量約為17 kDa，等電點(diǎn)3.94.1，它能耐一定的高溫，在90 C加熱34 min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團(tuán)。該蛋白的作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。在鈣離子的作用下才能起到暴露在鈣離子的作用下才能起到暴露疏水集團(tuán)發(fā)揮性能，結(jié)合蛋白質(zhì)疏水集團(tuán)發(fā)揮性能，結(jié)合蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識從而可以判斷其為基礎(chǔ)知識從而可以判斷其為鈣調(diào)鈣調(diào)蛋白。蛋白。材料的選擇材料的選擇材料的預(yù)處理材料的預(yù)處理成年健康雄性大鼠腦組織20克（比雌鼠體積大，成本較低物種易獲得）將切取的組織用4預(yù) 冷0.01mol/l的P

2、BS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液 ） 預(yù)處理過的組織預(yù)處理過的組織 細(xì)胞破碎（細(xì)胞破碎（高速珠高速珠磨法磨法） 制備制備組織細(xì)胞組織細(xì)胞懸液懸液（剪碎剪碎法法） 蛋白質(zhì)被釋放出蛋白質(zhì)被釋放出來來破碎剪碎法1.將組織塊放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10 ml PBS；3.用吸管吸取組織勻漿，用200目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)；高速珠磨法破碎機(jī)理：高速珠磨法是一種有效的細(xì)胞破碎方法，珠磨機(jī)是該法所用的設(shè)備，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖（1）。微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞膜破裂，釋出內(nèi)含物

3、。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。鈣調(diào)蛋白的粗提取鈣調(diào)蛋白的粗提取抽提 蛋白質(zhì)破碎后，使用適當(dāng)?shù)娜軇?，將蛋白質(zhì)提取溶解到溶劑當(dāng)中，常用稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑等電點(diǎn)3.94.1酸性蛋白質(zhì)稀堿性溶液抽提溶液堿性的程度，堿性過大則難以復(fù)性pH調(diào)至等電點(diǎn)偏堿的一側(cè)（4.1）粗提取物離心操作除去固體雜質(zhì)的上清液熱變性初步純化熱變性初步純化天然結(jié)構(gòu)%鈣調(diào)蛋白一般蛋白100熱穩(wěn)定性不同其他方法其他方法鹽析法等電點(diǎn)法有機(jī)溶劑法3 3親和色譜親和色譜配體配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物體復(fù)合物交聯(lián)試劑交聯(lián)試劑載體載體配體配體

4、載體與配載體與配體交聯(lián)體體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)游離游離配體配體洗脫結(jié)合耦聯(lián)作用機(jī)理作用機(jī)理金屬螯合親和層析金屬螯合親和層析鈣調(diào)蛋白的外形似啞鈴,有兩個球形的末端,中間被一個長而富有彈性的螺旋結(jié)構(gòu)相連,每個末端有兩個Ca2+ 結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一Ca2+ , 這樣,一個鈣調(diào)蛋白可以結(jié)合4個Ca2+ ,鈣調(diào)蛋白與Ca2+ 結(jié)合后的構(gòu)型相當(dāng)穩(wěn)定 。金屬螯合色譜金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基 與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相 上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱 氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合 作用而進(jìn)行分離步驟步驟1.制作金屬螯合親和色譜柱

5、：用濃度為0.2 mol/L的CaCl2溶液上柱。將上清液PH調(diào)制6-8，加入蛋白質(zhì)解離抑制劑。慢上樣3.再用配體CaCl2溶液洗脫，下方流出為目的蛋白液，用大使管或者燒杯盛裝之。2.上柱后依次用50ml bufferB、200ml含0.5mol/L NaCl的bufferB洗脫。下方用大試管或燒杯收集雜質(zhì)液。配體配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物體復(fù)合物步驟步驟目的：除去蛋白液中配體離子方法一：半透膜進(jìn)行透析方法二：將上次獲得目的蛋白液經(jīng)凝膠過濾色譜柱下方首次接受的溶液即為高純度的鈣調(diào)蛋白溶液；第二次接受到的即為配體離子的溶液。凝膠過濾色譜的洗脫定性分析分析鑒定定量分析定性分析定性

6、分析 分子量 凝膠電泳 質(zhì)譜(可同時鑒定分子量和純度) 活性 根據(jù)蛋白質(zhì)的功能選用不同的活性檢測方法 如：磷酸二酯酶( PDE)法 常用方法 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)的分子量和純度 MALDI-TOF-MS測定蛋白質(zhì)的分子量和純度SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測定蛋白質(zhì)分子量用SDS- PAGE檢測不同純化階段所獲得的提取液樣品中CaM的純度與相對分子質(zhì)量。電泳采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，120V 電壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像儀成像。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX 若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。定量分析紫外檢測法簡單快速不破壞樣品準(zhǔn)確度低考馬斯亮藍(lán)染色法簡單迅速干擾少靈敏