持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對(duì)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

1、持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對(duì)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響                作者：彭磊，胡蘊(yùn)玉，徐華梓，王臻，孟國(guó)林，孫崢，潘俊，胡經(jīng)緯【摘要】  目的探討持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境對(duì)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，揭示持續(xù)壓力致假體松動(dòng)下沉進(jìn)展及其術(shù)后活動(dòng)影響的生物學(xué)機(jī)制。方法以新西蘭兔的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)，觀察壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在20、60、100 kPa持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境下MTT反應(yīng)

2、的OD值顯著小于對(duì)照組，壓力值越大, OD值越小。20、60、100 kPa 持續(xù)性壓力可顯著抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖,抑制作用隨壓力值增大而增強(qiáng)。結(jié)論關(guān)節(jié)置換術(shù)后早期患者不宜過(guò)早下地，否則將產(chǎn)生持續(xù)性應(yīng)力，可以引起骨髓腔內(nèi)骨髓干細(xì)胞的抑制，不利于骨質(zhì)愈合。且易產(chǎn)生假體下沉和松動(dòng)。 【關(guān)鍵詞】  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞； 持續(xù)性壓力； 髖關(guān)節(jié)置換； 細(xì)胞增殖   Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of pressure on the proliferation of rabbit bone marrow str

3、omal cells (MSCs) and explain the relationship of the hip prosthesis submerge and loosening with continuous pressure after revision of total hip replacement.MethodA unit of MSCs pressure model was set up to load different pressures on MSCs cultured in vitro.ResultMSCs showed more proliferation capac

4、ity under discontinuous pressure. MTT assay was used to determine the cell proliferation of primarily cultured MSCs under discontinuous pressure. The MSCs OD value of pressured groups was much smaller than the control group at different times. Various magnitudes and durations of the discontinuous pr

5、essure could significantly suppress MSCs proliferation with the magnitude-dependent.ConclusionAt the early period after revision of total hip replacement, patients should lie and exercise on the bed until 6 weeks. Otherwise, the weight-bearing pressure may restrain MSCs proliferation which is harmfu

6、l to union and may cause prosthesis submerge and loose.  Key words：bone marrow stromal cells;  continuous pressure;  revision of total hip replacement;  cell proliferation骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的成骨細(xì)胞是骨髓腔內(nèi)主要的受力細(xì)胞，在人工關(guān)節(jié)置換病例中，其生命活動(dòng)狀況與假體傳導(dǎo)壓力有密切關(guān)系，本文應(yīng)用可控壓力細(xì)胞加載裝置和通過(guò)四唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)，觀察壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影

7、響，以期為揭示持續(xù)壓力致假體松動(dòng)下沉進(jìn)展及其術(shù)后活動(dòng)影響的生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。   1  材料和方法1.1  實(shí)驗(yàn)儀器  超凈工作臺(tái)（中國(guó)四達(dá)凈化技術(shù)研究所）CO2培養(yǎng)箱（NATURE）YMT-Z倒置顯微鏡（OLYMPUS）DG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（國(guó)營(yíng)華東電子管廠、第四軍醫(yī)大學(xué)聯(lián)合研制）實(shí)驗(yàn)材料:無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,含10%FBS的DMEM（含1U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）25 ml,100 ml培養(yǎng)瓶，24孔,96孔培養(yǎng)板(Gibco),含2%FBS的DMEM（含1U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素）胎牛血清（F

8、CS，浙江金華），噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma） 胰蛋白酶（上海生化試劑廠），ABC試劑盒（武漢博士德公司）1.2  實(shí)驗(yàn)方法1.2.1  兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的培養(yǎng)  出生1月的新西蘭兔1只，斷頭處死，無(wú)菌條件下取四肢長(zhǎng)骨，縱行剖開(kāi)，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，輕輕吹打，靜置1 min，使大塊組織沉降，取上清接種于10個(gè)25 ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24 h后換液，去除未貼壁的血細(xì)胞，以后每3 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部后，用0.25胰酶常規(guī)傳代，傳代比例為1：3。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。  礦化結(jié)節(jié)染色： 取第3代細(xì)胞，胰酶消

9、化，接種在25 ml培養(yǎng)瓶中，用礦化液(含20%胎牛血清、2 nmol/L -甘油磷酸鈉、50 g/ml維生素、10 nmol/L 地塞米松)連續(xù)培養(yǎng)30 d,在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。取30 d標(biāo)本，95酒精固定后行Von-Kossa染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。1.2.2  細(xì)胞加載裝置  本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞加載裝置是可控壓力細(xì)胞加載裝置（口腔醫(yī)院修復(fù)科提供）。該裝置由高壓儲(chǔ)氣室、控壓加載室、氣流量調(diào)控器、壓力檢測(cè)器、計(jì)時(shí)器所組成。高壓儲(chǔ)氣室儲(chǔ)備5%CO2，95%空氣，氣壓大于1.0 MPa?？貕杭虞d室通過(guò)氣流量調(diào)控器與高壓儲(chǔ)氣室連接，并由壓力檢測(cè)器和氣流

10、量調(diào)控器控制加載室室內(nèi)壓力，室內(nèi)壓力與設(shè)定壓力之誤差小于。1.2.3  細(xì)胞加載方法  按實(shí)驗(yàn)方案設(shè)定調(diào)試控壓加載室氣壓值。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入加載室內(nèi)，關(guān)閉室門。再開(kāi)啟氣流量調(diào)控器向加載室充氣加壓并計(jì)時(shí)。到達(dá)預(yù)定加載時(shí)間后，通過(guò)排氣閥排氣減壓并打開(kāi)室門。接受加載后的細(xì)胞重新放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)或加入試劑染色以觀察數(shù)量。1.2.4  分組  將生長(zhǎng)良好的第3、4 代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞按1X104個(gè)/孔隨機(jī)接種于7塊24孔培養(yǎng)板，14 h后細(xì)胞完全貼壁, 換新鮮含10%FCS的DMEM。按壓力施加類型不同分為持續(xù)性和間歇性壓力，每塊培養(yǎng)板的細(xì)胞為大組，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)將

11、4塊培養(yǎng)板分為4個(gè)大組即: 對(duì)照組、20 kPa持續(xù)組、60 kPa持續(xù)組、100 kPa持續(xù)組。每大組按觀察期分為1、3、5、7 d 4個(gè)小組。每小組樣本（細(xì)胞）為6孔。對(duì)照組不予加壓，20  、 60、 100 kPa組分別在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)每天施以20、60、 100 kPa的持續(xù)3 h壓力。1.2.5  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖的檢測(cè)方法  在規(guī)定的觀察期，分別給相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)小組加入（MTT, 5  mg/ml）60 l，繼續(xù)孵育4 h后吸棄孔內(nèi)液體備檢。當(dāng)各組觀察期的反應(yīng)均完成后，每孔加入二甲基亞砜（DMSO） 600 l，充分振蕩10 min，使

12、結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Rad, USA）測(cè)定各孔細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)的光吸收值（OD490 nm）。         1.2.6  數(shù)據(jù)處理  各組光吸收均值用spss配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1  細(xì)胞生長(zhǎng)狀況  原代培養(yǎng)后，細(xì)胞在第57 d內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣游出，以組織塊為中心成放射狀向外排列（見(jiàn)圖1）。細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，伸展良好，胞體豐滿，胞漿均勻，5代以前細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性(見(jiàn)

13、圖2)。2.2  不同觀察期骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化（表1）：自實(shí)驗(yàn)第1 d起，各實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值逐漸升高。觀察期越長(zhǎng)，OD值越高。實(shí)驗(yàn)組OD值小于對(duì)照組OD值。2.3  持續(xù)壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值的影響（表1）表1  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在不同壓力持續(xù)作用下的OD值（略）*表示各壓力組OD值均數(shù)顯著低于對(duì)照組，P0.01表示60 kPa組、100 kPa組OD值均數(shù)顯著低于20 kPa組，P0.05表示100 kPa組OD值均數(shù)顯著低于60 kPa組，P0.05  不同持續(xù)壓力條件下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化(表1) ：實(shí)驗(yàn)的第

14、3 d，20 kPa組與60 kPa組OD值均數(shù)之間無(wú)顯著差異，但均高于100 kPa組；實(shí)驗(yàn)的第5 d，不同壓力組OD值均數(shù)之間差異顯著，壓力越高，OD值越低；實(shí)驗(yàn)的第7 d，壓力較大組的OD值均數(shù)低于壓力較小組，P0.05。圖1  原代約7 d細(xì)胞即可長(zhǎng)滿，外觀為梭形、三角形（×100） （略）      圖2  原代培養(yǎng)4周左右可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)形成（×40）（略）3  討論   髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后經(jīng)常發(fā)生假體松動(dòng)、下沉、移位甚至脫落，是關(guān)節(jié)翻修手術(shù)重要因素之一。假體安

15、裝或者設(shè)計(jì)不當(dāng)都會(huì)使骨組織受到不良的應(yīng)力作用，也可使骨質(zhì)破壞。關(guān)節(jié)外科所開(kāi)展的生物力學(xué)研究，多偏重于闡明不同假體設(shè)計(jì)對(duì)股骨及其支持組織的應(yīng)力分布產(chǎn)生何種影響。由于骨組織生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，假體接觸應(yīng)力將引起骨組織應(yīng)力細(xì)胞的變化情況及其機(jī)理，仍然是個(gè)值得探索的新領(lǐng)域。  有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，機(jī)械性應(yīng)力應(yīng)變是骨骼構(gòu)建與重塑的基本動(dòng)因1。適宜的應(yīng)力環(huán)境可以促進(jìn)骨代謝朝著最佳水平發(fā)展，反之則可導(dǎo)致不良后果。骨骼內(nèi)的某些細(xì)胞能夠感知生物物理性信號(hào)（如力學(xué)信號(hào)、電信號(hào)等），加工整合這些信號(hào)，并將之轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的骨骼結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞的這一功能被稱為力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能（mechanotransductio

16、n）1。這表明在骨骼的功能適應(yīng)性機(jī)制中，力學(xué)現(xiàn)象與骨骼的構(gòu)建、重塑是通過(guò)細(xì)胞的功能性變化而直接聯(lián)系起來(lái)的。這些具有力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的細(xì)胞，由于它們對(duì)力學(xué)刺激敏感，故又稱其為力學(xué)敏感性細(xì)胞。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分別是骨骼形成和吸收的效應(yīng)性細(xì)胞。成骨細(xì)胞是骨骼中最重要的活性細(xì)胞，一般認(rèn)為該細(xì)胞是力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)應(yīng)力應(yīng)變信號(hào)進(jìn)行感知的感受性細(xì)胞，同時(shí)作為效應(yīng)性細(xì)胞增強(qiáng)骨骼的形成。  細(xì)胞加載裝置是研究體外活細(xì)胞對(duì)應(yīng)力效應(yīng)的先決條件。1985年Benase使用細(xì)胞牽張加載裝置（flexercell strain unit）, 通過(guò)彈性硅膠膜形變使所貼附的細(xì)胞受力，觀察細(xì)胞在周期性牽拉

17、作用下的變化。該系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)肌細(xì)胞、韌帶細(xì)胞、骨細(xì)胞在張力作用下的反應(yīng)發(fā)揮了重要作用，但其加載載荷的范圍受彈性硅膠膜的性能和面積限制，且細(xì)胞受力的狀況有可能受細(xì)胞對(duì)彈性硅膠膜粘附效果的影響。細(xì)胞液壓加載裝置3的問(wèn)世為研究定量壓力條件下的細(xì)胞力學(xué)反應(yīng)提供了可能。  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化來(lái)的成骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)置換手術(shù)后主要的應(yīng)力細(xì)胞，同時(shí)具有合成膠原形成膠原纖維，分泌重要的活性物質(zhì)以調(diào)控骨內(nèi)組織的代謝等功能。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生活在骨髓腔中, 該組織既是細(xì)胞物質(zhì)交換的媒體又是傳遞和緩沖應(yīng)力的介質(zhì)。假體受力發(fā)生位移的同時(shí)，必然擠壓骨內(nèi)松質(zhì)骨的組織液致使其組織液液壓亦即骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的受力改變

18、。因此，通過(guò)改變液壓的方式實(shí)施對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞加載能比較好地模擬臨床關(guān)節(jié)置換術(shù)后實(shí)際。本實(shí)驗(yàn)所用的可控壓力細(xì)胞加載裝置是在Yousefian 2裝置基礎(chǔ)制作的。該細(xì)胞力學(xué)模型的建立，為進(jìn)一步探索和揭示關(guān)節(jié)置換假體下沉的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)理提供了條件。  應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)雖有報(bào)導(dǎo)，但結(jié)論并不一致。Ozawa等則通過(guò)向壓力培養(yǎng)箱持續(xù)注入三種持續(xù)加壓的混合空氣, 作用于鼠成骨樣細(xì)胞持續(xù)性壓力，證實(shí)持續(xù)性壓力對(duì)成骨細(xì)胞有抑制作用3。  本研究用可控壓力細(xì)胞加載裝置和MTT法觀察了體外環(huán)境下正壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響，在體外培養(yǎng)環(huán)境下觀察壓力對(duì)骨髓基

19、質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響。取第34代原代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用可控壓力細(xì)胞加載裝置分別持續(xù)性施加20、60、100 kPa的壓力, 分別在培養(yǎng)的第1、3、5、7 d用MTT法測(cè)定各組的OD值。  表1證實(shí)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在20、 60、100 kPa持續(xù)性壓力培養(yǎng)環(huán)境下，MTT反應(yīng)的OD值顯著小于對(duì)照組，壓力值越大, OD值越小。20、60、100 kPa 持續(xù)性壓力可顯著抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞增殖, 該抑制作用隨壓力值增大而增強(qiáng)。發(fā)現(xiàn)自實(shí)驗(yàn)第3 d起，持續(xù)性壓力各實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值逐漸升高，觀察期越長(zhǎng)，OD值越高，其中對(duì)照組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值升高幅度顯著大于加壓

20、組。由于MTT比色法是基于活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為難溶性藍(lán)紫色結(jié)晶物（Formanzan）沉積于細(xì)胞內(nèi)，且該結(jié)晶被DMSO溶解并在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀顯色，其OD值間接反應(yīng)被檢樣本內(nèi)的活細(xì)胞數(shù)的原理，因此，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng) d 20 kPa以上持續(xù)性壓力作用后，其增殖受到明顯的抑制，并且該壓力抑制作用具有時(shí)間效應(yīng)。  據(jù)Kletsas4,5報(bào)導(dǎo)，成骨細(xì)胞牽張力作用1-6 h后就可以出現(xiàn)DNA合成活躍。而本文實(shí)驗(yàn)的第1 d，壓力組骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值與對(duì)照組之間并無(wú)顯著差異。這表明若從細(xì)胞學(xué)水平觀察壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的效應(yīng)，其效應(yīng)出現(xiàn)在接受刺激的1 d之后

21、。  比較不同持續(xù)性壓力條件下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的OD值變化可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)的第 d 20 kPa組與60 kPa組OD值均數(shù)之間無(wú)顯著差異；實(shí)驗(yàn)的第 d，不同壓力組組間OD值均數(shù)的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著；而實(shí)驗(yàn)第 d，不同壓力組OD值均數(shù)間差異顯著，這提示壓力對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)并不完全是直線型的。  本實(shí)驗(yàn)提示臨床關(guān)節(jié)置換術(shù)后，早期下地產(chǎn)生的持續(xù)性應(yīng)力，會(huì)明顯引起骨髓腔內(nèi)骨髓干細(xì)胞增殖的抑制，不利于骨的重建愈合，更易產(chǎn)生假體下沉和松動(dòng)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Turner CH, Akhter MP.The mechanical of bone adaptation. In: Mechanical loading of bones