分子生物學實驗

1、分子生物學實驗報告姓 名： 學 院： 專業(yè)班級： 學 號： 一、前期工作及引物設(shè)計（一）實驗目的：尋找一個合適的基因，并設(shè)計出與之相對應的引物，用于后續(xù)實驗。（二）實驗原理：引物設(shè)計的一般原則： 引物長度：15-30bp GC含量：一般引物序列中G+C含量一般為40%60% 退火溫度：退火溫度需要比解鏈溫度低5，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加 避免擴增模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域 與靶DNA的錯配：當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個條帶出現(xiàn)。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測 引物末端：引物3端是延

2、伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 引物的二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。（三）操作方法：1、閱讀一些與小麥抗旱基因相關(guān)的文章，并最終選出基因TAPK7。LOCUSAB1253081583 bpmRNA linearPLN 15-FEB-20082、根據(jù)引物設(shè)計原則，用相關(guān)軟件Primer6設(shè)計兩對引物。3、在網(wǎng)站NCBI上用BLAST檢驗所設(shè)計的引物，并從中選出較好的一對引物。（四）實驗結(jié)果：前引物：5-CCAACATCATC

3、CGCTTCA-3（position:396引物長度：18）后引物：5-CCTGCTCATCCTCCTCTT -3（position:1190引物長度：18） （產(chǎn)物長度795）（五）討論：雖然我們自己設(shè)計出來引物，但是后來做PCR的效果也不好，后來還換了引物。所以希望老師能在這些我們還未學習到的地方給一些經(jīng)驗指導，或者提供一些資料參考，來保證我們的實驗效果。二、目的基因提取及驗證（一）實驗目的：根據(jù)所設(shè)計的引物，用克隆基因組和反轉(zhuǎn)錄兩種方法，得到目的基因cDNA。（二）實驗原理：1、提取基因組：十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中是可

4、溶的,當降低溶液鹽濃度到一定程度時,從溶液中沉淀。在本實驗方案中，首先通過含有CTAB高鹽抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和細胞碎片沉淀，離心后，溶液分為三層，上層為CTAB與核酸的復合物的高鹽溶液，中層為蛋白質(zhì)和細胞碎片，下層為氯仿。取出上清加入異丙醇使核酸沉淀。2、提取RNA：DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進行區(qū)分。RNA提取的另一個關(guān)鍵問題就是抑制或去除環(huán)境中RNA酶，判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個標準，一是純度，二是完整性（是否被降解）。3、利用提取的基因組和設(shè)計

5、好的引物一起做PCR，便可得到目的基因。利用提取的RNA和設(shè)計的引物一起做RT-PCR，便可得到目的基因的cDNA。之后再做電泳檢驗擴增出的條帶是否和目的基因的分子量大小相符。（三）實驗步驟：（1）基因組DNA提取1. 取0.15g左右小麥葉片，在液氮中研磨后放入1.5ml離心管中，加入700l抽提液（65預熱）混勻，加4 ul RNase室溫靜置2min。放入65水浴中，裂解40-60分鐘，期間溫和混勻幾次。2. 取出裂解好的DNA ，加入700l 氯仿：異戊醇（24：1），猛烈混勻，離心（10000rpm，10分鐘）。3. 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預冷異丙醇，緩慢

6、混勻后，再猛烈混勻，使DNA成團，-20放置半小時以上。4. 將析出的DNA 離心，14000rpm，10分鐘。5. 去掉上清，將沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，揮發(fā)除去乙醇，溶于50l TE或水中。（2）提取RNA：1. 稱取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。2. 加入1 ml Trizol Reagent，1530×5min。 3. 加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，1530×3min。4. 冷凍離心12 000 rpm×15min。5. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，加0.5ml預冷異丙醇,混勻，-

7、20放置20min。6. 冷凍離心12 000 rpm×10min，棄上清。7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并懸浮沉淀，10000 rpm×2min，揮發(fā)除去乙醇。8. 加入30 l DEPC 處理過的ddH2O溶解RNA。（3）PCR及RT-PCR：1. 按下表加入試劑，并小心混勻。模板為實驗一中提取的質(zhì)粒DNA。試劑體積（30µl）ddH2O12µlPrimer P1（µM）1µlPrimer P2（µM）1µl模板1µl2 x Taq Mix15µl2. 設(shè)置PCR程序： 9

8、4 180s 94 45s 32 cycles: 5545s 72 45s 72 600s3. 運行PCR程序（4）電泳分析：用2%的瓊脂凝膠，做電泳，在中間點入Maker。（四）實驗結(jié)果：電泳顯示：用基因組擴增的一組條帶很微弱，用RNA做反轉(zhuǎn)錄的一組則沒有任何條帶。之后又重復做了幾次擴增和電泳，還是沒有清晰的條帶，因此便用了實驗室的一個基因和與之配套的引物進行下一步實驗。（五）討論：1、在反轉(zhuǎn)錄法提取RNA中，由于我們選取的是小麥的一個抗旱基因，而實驗用的小麥可能沒有表達該基因，提取的RNA中沒有相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄片段，因此在做反轉(zhuǎn)錄時擴增失敗。2、在前期準備對設(shè)計的引物進行檢驗時，一些看不懂參

9、數(shù)也沒在意，有可能也是擴增失敗的原因之一。3、基因組DNA在提取時，最后一步出現(xiàn)錯誤，加了自來水而不是ddH2O，導致其中鹽濃度過高，測得OD值也只有1500左右，可能是擴增失敗的原因之一。三、制作感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選（一）目的掌握感受態(tài)細胞制備和轉(zhuǎn)化及藍白班篩選的原理和基本方法。（二）原理受體細胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。（三）操作步驟（1）感受態(tài)細胞的制備(0.1M CaCl2方法)1. 從LB固體平板挑單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)

10、，37×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。2. 將活化菌體按15接種到LB中，擴大培養(yǎng)37×200rpm×2h，至OD600約為0.4。3. 取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4 離心8 000rpm×1 min。 4. 棄上清，加500 l 0.1M CaCl2 (滅菌預冷)洗菌體，4冷凍離心8000rpm×1 min。5. 徹底除去殘液, 加200 l 0.1M CaCl2 (滅菌預冷)，懸浮菌體。6. 冰浴靜置 20 min ，4冷凍離心8000rpm×1 min。7. 棄上清，加100 l 0.1M Ca

11、Cl2 (滅菌預冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細胞。（2）質(zhì)粒載體與外源DNA連接：1. 取一個1.5ml離心管依次加入下列試劑:2×ligation buffer：5lpGEM-T Easy：1l目的片段：2lT4 DNA連接酶：1lddH2O：1l 2. 離心機離心30s，使反應體系充分混合。3. 4過夜連接。（3）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化1. 將連接產(chǎn)物加入100 l制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置10-20 min。2. 42熱激90s。3. 迅速冰浴3min。4. 加入600 l LB液體培養(yǎng)基，37輕搖培養(yǎng)45min。5. 30l X-gal和6 l IPTG混勻涂布在含有50 g

12、/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)平板中。6. 取菌液100 l涂板。7. 37倒置，避光培養(yǎng)16-20 h。（4）藍白斑篩選： 由于載體上有氨芐抗性基因，在培養(yǎng)基60-70攝氏度時，加入氨芐，在接種大腸桿菌，便會出現(xiàn)藍白斑。挑取單菌落進行菌落進行擴大培養(yǎng)，之后PCR鑒定。（四）實驗結(jié)果：經(jīng)過一天的培養(yǎng)后培養(yǎng)皿并沒有出現(xiàn)藍白斑，不過PCR擴增和電泳分析后，發(fā)現(xiàn)了目的基因，但雜帶較多。后來用基因組和引物進行擴增，用于轉(zhuǎn)膜。（五）討論：1、沒有出現(xiàn)藍白斑的原因可能是抗生素放置時間太長而失效，可能是培養(yǎng)時間不夠。但對連接載體進行PCR擴增后發(fā)現(xiàn)了目的基因，說明載體連接正確。所以可以從培養(yǎng)皿上取一些細菌擴大培養(yǎng)

13、，做進一步的鑒定。2、在做轉(zhuǎn)化時，熱激前可先將其輕輕混勻，可以提高轉(zhuǎn)化效率。四、提取質(zhì)粒DNA（一）目的學習堿裂解法提取質(zhì)粒的原理。（二）原理質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價閉合環(huán)狀的特點，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離。實驗室普遍采用的堿裂解法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。（三）實驗步驟：1. 柱平衡步驟：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500L 的平衡液BL，12,000rpm（13,400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附

14、柱重新放回收集管中。（請使用當天處理過的柱子）2. 取1-5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12,000rpm（13,400×g）離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。3. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250L 溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。4. 向離心管中加入250L 溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次使菌體充分裂解。5. 向離心管中加入350L 溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm（13,400&#

15、215;g）離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。6. 將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm（13,400×g）離心30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。7. 向吸附柱CP3 中加入600L 漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（13,400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。8. 重復操作步驟7。9. 將吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm（13,400×g）離心2min，目

16、的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。10. 將吸附柱CP3 置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100L 洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min，12,000rpm（13,400×g）離心2min 將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。（四）實驗結(jié)果：質(zhì)粒的提取順利，經(jīng)雙酶切電泳檢驗后，有明顯的條帶。（五）討論：【如何更好的提取質(zhì)粒？】用試劑盒提取質(zhì)粒時，最好注意下面幾個細節(jié)：1、新鮮菌液。-20凍存的菌體沉淀提取質(zhì)粒的質(zhì)量不如來自新鮮菌液的。2、不要處理過多的菌液。3、溶液P2和溶液P3處理的時候動作不要劇烈。特別是溶液III動作過于劇烈，容易導致離心蛋白的效果不佳，也容易導致質(zhì)粒終產(chǎn)

17、物中的菌體基因組DNA污染的增大。4、加入漂洗液時，可以靜置一下再離心，如果400ulX2兩次漂洗效果可能會更好。但是按試劑盒操作說明只700ul一次漂洗所獲得的質(zhì)粒質(zhì)量也是沒有問題的。5、采用硅膠膜類試劑盒時，一定要在漂洗后再次離心13min，以徹底去除漂洗液。漂洗液中含有乙醇，殘留在硅膠膜上會導致質(zhì)粒洗脫效率下降，也會造成質(zhì)粒后續(xù)操作例如酶切效率的降低。6、離心洗脫前最好靜置12min。如果有時間也可以將50ulX2兩次洗脫，但實際上一次洗脫的效率足夠讓你獲得足量的質(zhì)粒DNA。7、采用試劑盒提取的質(zhì)粒DNA應該基本上只有一條超螺旋，其他帶條都是很模糊的比較多。 8、 提質(zhì)粒大都提的有三條帶

18、，一般是三條，不可能只有一條。五、轉(zhuǎn)膜及地高辛標記的探針制作及雜交（一）目的學習Southern雜交的原理及操作方法。（二）原理在瓊脂糖凝膠上按片段大小電泳分離待檢的DNA；用NaOH對凝膠中的DNA進行變性處理；通過毛細管作用將單鏈DNA吸附到硝酸纖維素膜上；然后用標記好的探針進行雜交，洗掉沒有雜交的游離探針；經(jīng)放射性自顯影（放射性標記探針）或生化檢測（非放射性標記）就可以證明基因片段與已知探針是否具有同源性，達到檢測樣品基因的目的。因此，Southern印跡雜交包括兩個步驟把電泳分級的DNA轉(zhuǎn)移到固定支持膜上。與標記的DNA探針雜交。（三）實驗步驟：1. 用之前提取的基因組加完全引物，做PCR擴增目的基因。2. PCR完成之后，點樣電泳（點樣時，留10ul做探針），然后觀察是否擴增出了目的基因，如果有的話，進行下一步的轉(zhuǎn)膜操作。3. 按照實驗指導書上的操作步驟進行轉(zhuǎn)膜操作。4. 制作地高辛標記的探針：先將DNA熱變性：把DNA置于沸水中，水浴10分鐘。然后，迅速地插入碎