膽堿能傳出性前庭神經(jīng)元的分布

1、    膽堿能傳出性前庭神經(jīng)元的分布        摘要目的：觀察膽堿能傳出性前庭神經(jīng)元的分布。方法：采用辣根過氧化酶逆行追蹤和免疫組化技術(shù)觀察大鼠堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達，了解傳出性前庭神經(jīng)元的分布。結(jié)果：大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽性傳出性前庭神經(jīng)元分布在面神經(jīng)膝內(nèi)側(cè)E群、背外側(cè)E群及腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核，以內(nèi)側(cè)E群為主。結(jié)論：乙酰膽堿分布于各群傳出性前庭神經(jīng)元，并作為神經(jīng)遞質(zhì)而具有重要的功能。關(guān)鍵詞前庭神經(jīng)傳出神經(jīng)元膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫組織化學 Distribution of choline

2、rgic efferent vestibular neuronsCHI Fang-luWANG Zheng-minWU Li-wen（Hearing Laboratory of Ministry of Public Health,Eye Ear Nose & ThroatHospital of Shanghai Medical University,Shanghai 200031）LI Kuan-yan（State Key Laboratory of Neurobiology,Shanghai Medical University）AbstractObjective:To invest

3、igate the effect and distribution of cohlinergic efferent vestibular neurons in normal wistar rat.Method:HPR retrograde tracer and Immunocytochemical techniques were used.Result:Results show that AchT immunoreactive neurons locate in dorsolateral and dorsomedial to genu of the facial.Few neurons sca

4、tter in the parvocellular nucleus.Conclusion:As a neural transmitter,acetylcholine distribute in efferent vestibular neurons and play an important role.Key wordsVestibular nerveEfferent neuronsCholine acetyltransferaseImmunohistochemistry目前對傳出性前庭神經(jīng)系統(tǒng)的研究較少，一個主要原因是傳出性前庭神經(jīng)元由幾組不多的神經(jīng)細胞組成，不是固定的神經(jīng)核團，其發(fā)出的神經(jīng)

5、纖維在前庭神經(jīng)中只占很小比例，定位比較困難。本研究通過觀察傳出性前庭神經(jīng)系統(tǒng)主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)的合成酶膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(AchT)的表達，了解傳出性前庭神經(jīng)元的分布。1材料與方法1.1辣根過氧化酶(HRP)逆行追蹤DAB法顯色體重120 g的雄性大鼠3只，用微量注射器經(jīng)耳蝸底回鉆孔，取向前庭方向注射25% HRP 5 l，24 h后心內(nèi)灌注固定，作經(jīng)耳蝸核橫斷面連續(xù)35 m厚的冰凍切片，用DAB法顯色，陽性細胞呈棕黃色，胞漿內(nèi)有同色深顆粒，胞核明亮無顆粒。1.2AchT免疫組化方法1.2.1主要試劑：鼠抗鼠AchT抗體(Boehringer Mannheim公司)；羊抗鼠ABC

6、試劑盒(上海華美生化試劑公司)。1.2.2動物組織取材與標本處理：正常雄性Wistar大鼠16只，體重120 g。大鼠麻醉后將雙耳棒插入外耳道，使大鼠頭部固定在頭顱立體定向儀上。切開顱頂皮膚，在前囟向右及向后各1.5 mm交界處定位作顱骨鉆孔。用微量注射器垂直進針3.2 mm達側(cè)腦室，10 min后緩慢注射秋水仙素20 l(10 g/L)。48 h后4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，取出腦組織浸入4%多聚甲醛-20%蔗糖緩沖液中后固定。作腦橋橫斷面冰凍切片，片厚35 m，收集在4的2%多聚甲醛緩沖液中。1.2.3免疫組織化學方法：在第8對腦神經(jīng)平面，隔二片取一片腦組織，用飄浮法作ABC免疫反應。PBS

7、漂洗3次，0.3% triton-10%小牛血清(11)中1 h，14的鼠抗鼠AchT抗體溶液中孵育1 h改置于4冰箱48 h。PBS漂洗3次，置入1200羊抗鼠溶液(二抗)1 h。漂洗后置入1200的AB反應液中37 1 h。用DAB磷酸鎳胺法顯色，陽性免疫反應細胞質(zhì)呈灰藍色，有同色顆粒，胞漿無顆粒。陰性對照的腦片不加AchT抗體，其余步驟相同。2結(jié)果2.1HRP陽性傳出性前庭神經(jīng)元的定位如1所示，HRP陽性反應細胞位于第四腦室的面神經(jīng)膝內(nèi)側(cè)及背外側(cè)，稱內(nèi)側(cè)E群及背外側(cè)E群神經(jīng)元，面神經(jīng)升支兩側(cè)的腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(CPR)。內(nèi)E群神經(jīng)元為小梭形神經(jīng)元沿面神經(jīng)膝內(nèi)側(cè)呈弧形分布，背外側(cè)E群為類圓形

8、細胞，呈簇狀分布于面神經(jīng)膝外上方，另有部分在第四腦室外側(cè)緣處。1傳出性前庭神經(jīng)元分布示意Group E：E組神經(jīng)元(內(nèi)側(cè)及背外側(cè)群)，CPR：橋腦網(wǎng)狀核，g7：面神經(jīng)膝，MVe：前庭內(nèi)側(cè)核，4V：第四腦室，LVe：前庭外側(cè)核，7：面神經(jīng)核，Sp5、sp5：三叉神經(jīng)核，VCo：耳蝸核，EVN：傳出性前庭神經(jīng)，ECN：傳出性耳蝸神經(jīng)，SCA：上半規(guī)管，HCA：水平半規(guī)管2.2AchT陽性傳出性前庭神經(jīng)元的分布正常AchT陽性細胞主要出現(xiàn)在橋腦面神經(jīng)膝內(nèi)E群神經(jīng)元，為小梭形神經(jīng)元沿面神經(jīng)膝內(nèi)側(cè)呈弧形分布，面神經(jīng)膝內(nèi)側(cè)E群AchT陽性細胞的出現(xiàn)率為75%(12/16)，左側(cè)(8.33±4.2

9、3)只，右側(cè)(8.33±4.89)只(P0.05)，見2。面神經(jīng)膝背外側(cè)E群神經(jīng)元的AchT陽性神經(jīng)元出現(xiàn)率為43.75%(7/16)，有兩種類型：一種位于第四腦室底外側(cè)部，為類圓形細胞簇狀分布緊貼于面神經(jīng)膝外側(cè)緣；另一種為多角形細胞散在于前庭外側(cè)核及其外上方(3)。CPR陽性神經(jīng)元較少，位于面神經(jīng)根兩側(cè)為梭形細胞，在三叉神經(jīng)運動核平面為多角形陽性大細胞(4)，兩側(cè)陽性神經(jīng)元數(shù)基本相等。3討論傳出性前庭神經(jīng)系統(tǒng)由幾組神經(jīng)元組成，發(fā)出的神經(jīng)纖維經(jīng)前庭神經(jīng)達外周前庭器官的前庭感受器上皮，其主要神經(jīng)遞質(zhì)是Ach前庭神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性遞質(zhì)1。傳出性前庭神經(jīng)系統(tǒng)與傳入性前庭神經(jīng)形成了一個反饋

10、通路，其功能是調(diào)節(jié)前庭傳入信息。AchT是Ach的合成酶，其活性反映了Ach的活性。由于傳出性前庭神經(jīng)元的AchT表達量少，用秋水仙素側(cè)腦室注射可阻斷其經(jīng)軸突向外周末梢傳遞，以便在神經(jīng)元聚集相對濃度。2AchT陽性內(nèi)側(cè)E群神經(jīng)元4V：第四腦室，g7：面神經(jīng)膝，箭頭指處為AchT陽性內(nèi)側(cè)E群神經(jīng)元3AchT陽性背外側(cè)E群神經(jīng)元g7：面神經(jīng)膝，箭頭指處為AchT陽性背外側(cè)E群神經(jīng)元4腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核區(qū)AchT陽性細胞箭頭指處為CPR區(qū)多角形AchT陽性神經(jīng)元傳出性前庭神經(jīng)元位于腦橋，其末梢分布于前庭終器，故經(jīng)外周前庭吸收的HPR可逆行傳送至傳出性前庭神經(jīng)元；而傳入性前庭神經(jīng)元位于內(nèi)聽道的Scarpa

11、神經(jīng)節(jié)，故前庭核的第二級傳入神經(jīng)元無HPR陽性反應。因此HPR逆行追蹤可用于傳出性前庭神經(jīng)元的定位。本研究采用Wistar大鼠的腦干標本，觀察到AchT陽性細胞多數(shù)位于面神經(jīng)膝內(nèi)外側(cè)E群神經(jīng)元，以內(nèi)側(cè)E群為主。外側(cè)E群神經(jīng)元有兩種類型，一種位于第四腦室底外側(cè)部，另一類緊貼于面神經(jīng)膝外上方。各組AchT陽性神經(jīng)元的分布兩側(cè)相等。膽堿能免疫活性神經(jīng)末梢廣泛分布于5個前庭終器(球囊、橢圓囊、3個半規(guī)管)。有兩種膽堿能的前庭末梢，一種較大，另一種為中小型。半規(guī)管和橢圓囊傳出性前庭神經(jīng)末梢的膽堿能活性較強，球囊則較弱。即使在半規(guī)管壺腹嵴，傳出性前庭神經(jīng)末梢膽堿能活性分布也不一致，在壺腹嵴的周邊部活性較強

12、，在中心區(qū)較弱2。用逆行追蹤和AchT mRNA原位雜交的方法，觀察到90%的外側(cè)E群神經(jīng)元AchT有陽性表達，100%內(nèi)側(cè)E群神經(jīng)元有AchT mRNA的陽性表達，60%的CPR區(qū)神經(jīng)元AchT mRNA陽性表達3。Ach可以迅速增加前庭毛細胞內(nèi)Ca2+濃度，通過對前庭毛細胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)，起到抑制性作用，這些作用受傳出性前庭神經(jīng)系統(tǒng)的控制4。(編輯 陳蓓)遲放魯（上海醫(yī)科大學眼耳鼻喉科醫(yī)院衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學重點實驗室上海，200031）王正敏（上海醫(yī)科大學眼耳鼻喉科醫(yī)院衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學重點實驗室上海，200031）李寬（上海醫(yī)科大學神經(jīng)生物國家重點實驗室）吳?雯（上海醫(yī)科大學眼耳鼻喉科醫(yī)院衛(wèi)生

13、部聽覺醫(yī)學重點實驗室上海，200031）參考文獻1，Schwarz D W F,Satoh K,Schwarz I E,et al.Cholinergic innervation of the rats labyrinth.Exp Brain,1986,64:19262，Wackym P A,Popper P,Ward P H,et al.Cell and molecular anatomy of nicotinic acetylcholine receptor subunits and calcitonin gene-related peptide in the rat vestibular system.Otolaryngol Head Neck Surg,1991,105:4935103，Bridgeman D,Hoffman L,Wackym P A,et al.Distribution of choline acetytransferase mRNA in the efferent vestibular neurons of t