抗變形鏈球菌SAⅠⅡ單抗重鏈可變區(qū)基因克隆及序列分析

1、    抗變形鏈球菌SA/單抗重鏈可變區(qū)基因 克隆及序列分析        摘要 目的:從抗變形鏈球菌SA/單抗雜交瘤細(xì)胞系2B12F6中擴(kuò)增克隆重鏈可變區(qū)基因。方法:采用PCR技術(shù)和基因工程技術(shù),擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞系2B12F6的重鏈可變區(qū)基因并克隆入載體pUC18,Sanger雙脫氧鏈末端終止法測(cè)定核苷酸序列。結(jié)果:重鏈可變區(qū)基因全長(zhǎng)360 bp,編碼118個(gè)氨基酸,其框架區(qū)與發(fā)表的小鼠重鏈可變區(qū)基因序列有70%的同源性,符合鼠重鏈可變區(qū)基因的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)論:抗變形

2、鏈球菌SA/單抗雜交瘤細(xì)胞系2B12F6重鏈可變區(qū)基因的獲得是構(gòu)建抗變形鏈球菌SA/基因工程抗體的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 變形鏈球菌 單克隆抗體 可變區(qū)基因 核苷酸序列Cloning and Sequencing of Variable Region Gene of Heavy Chainof Monoclonal Antibody Against SA / of Streptococcus mutansWen LiyaDepartment of Oral Medicine of 309 Hospital, BeijingYan Yan, Ying Wen, Wu Xingan, et alDepart

3、ment of Microbiology, the Fourth Military Medical UniversityAbstract Objective:To clone and sequence a immunoglobulin variable region of heavy chain(VH) from a mouse hybridoma 2B12F6, which produce monoclonal antibody against SA / of Streptococcus mutans.Methods: The immunoglobulin variable region g

4、ene of heavy chain of 2B12F6 was amplified and cloned into pUC18 by using PCR technique and gene engineering technique, and then the gene sequence was analyzed by Sanger's method.Results: The VH gene segment was 360 base pairs in length and coded 118 amino acids, and the homology of framework of

5、 VH gene and mouse VH gene published was 70%, which accorded with the feature of mouse VH gene. Conclusion: The VH gene gained from 2B12F6 could provide the possibility of construction of gene engineering antibody against SA / of Streptococcus mutans.Key words: Streptococcus mutans monoclonal antibo

6、dy variable region gene DNA sequence目前對(duì)于抗變形鏈球菌表面蛋白抗原/(surface protein antigen /,SA/)單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)用于防齲的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)該McAb可抑制變形鏈球菌在牙齒表面的粘附1,2,這說明McAb用于防齲值得探討。但是鼠McAb在人體應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生的人抗鼠抗體(human anti-mouse antibody,HAMA)導(dǎo)致的過敏反應(yīng)又限制了McAb的應(yīng)用3。隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用基因工程技術(shù)可改建鼠McAb從而克服鼠McAb在人體產(chǎn)生的副作用。有關(guān)抗變形鏈球菌SA/

7、McAb基因工程抗體的構(gòu)建目前在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。1 材料和方法1.1 細(xì)胞培養(yǎng)4抗變形鏈球菌MT6R SA/McAb雜交瘤細(xì)胞株2B12F6按雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)則調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105個(gè)細(xì)胞。1.2 細(xì)胞總RNA提取5及cDNA合成培養(yǎng)細(xì)胞離心后懸浮于10mmol/L TE200l,置冰浴5分鐘,加入5%NP-40 5l,兩次間隔5分鐘,再加入10mmol/L TE200l,2×RES-1400l及等體積酚/氯仿-異戊醇抽提,離心吸上層液相再反復(fù)抽提1次,吸上層液相于Eppendorf管中,加1/10l 3M NaAc和1倍-20無水乙醇混勻,置-70 20分鐘,離心棄上清后

8、再用-2070%乙醇洗滌1次,37干燥,沉淀物溶于12l DEPC處理的滅菌超純水中,取1 l經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光燈下觀察結(jié)果。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求合成cDNA第一鏈。1.3 PCR擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物補(bǔ)平、回收在50l反應(yīng)液中含超純水25l,10×Taq緩沖液4l,25 mmol/L MgCl2 3l,10 mmol/L 4×dNTP2l,引物各2.5l,95變性5分鐘后加Taq DNA聚合酶5,然后按94.5變性50秒,60褪火50秒,72延伸60秒,循環(huán)35次后72繼續(xù)延伸5分鐘,取10l反應(yīng)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。經(jīng)抽提干燥的PCR產(chǎn)物中加

9、入:超純水16l,10×Klenow緩沖液2l,4×dNTP 1 l,Klenow酶1l混勻,置373小時(shí)后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳回收補(bǔ)平后的PCR產(chǎn)物,并行常規(guī)抽提,干燥,-20保存?zhèn)溆谩?.4 2B12F6VH基因的克隆用平端連接法將上述PCR產(chǎn)物與pUC18載體連接,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌JM109,隨機(jī)挑選菌落提取質(zhì)粒用Hind和EcoR雙酶切,篩選陽性克隆,進(jìn)一步經(jīng)三組酶切鑒定。1.5 序列分析用雙脫氧末端終止法測(cè)定序列。按照測(cè)序試劑盒說明進(jìn)行。陽性克隆菌種液按1100接種于50 ml 2×YT培養(yǎng)液中,37搖床培養(yǎng)15小時(shí),抽提及純化質(zhì)粒后經(jīng)變性,褪火及-

10、P32標(biāo)記反應(yīng),電泳2小時(shí)凝膠置-20放射自顯影24小時(shí)后行序列分析。2 結(jié) 果2.1 提取細(xì)胞總RNA1l提取物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外光燈下顯示28 S和18 S條帶清晰,無基因組DNA污染,降解的RNA量較少。2.2 PCR擴(kuò)增VH基因10l擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為360 bp,非特異性帶少(1)。12B12F6VH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A:2B12F6VH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B:DNA markerPGEM-7zf(+)/Hae2.3 陽性克隆的鑒定篩選出的陽性克隆再次經(jīng)三組酶切鑒定,表明篩選出的陽性克隆含有插入的外源性DNA片段(2)。22B12F6VH/PU

11、C18陽性克隆酶切鑒定A:DNA markerPGEM-7zf(+)/HaeB:EcoRI+BamH I酶切片段C:PstI酶切片段D:EcoRI+PstI酶切片段2.4 序列分析2B12F6VH基因核苷酸和氨基酸序列經(jīng)放射自顯影后可見VH基因片段和Kabat抗體基因庫中的小鼠抗體重鏈(A)組有較高的同源性,其特點(diǎn)是:基因長(zhǎng)度為360 bp,序列兩端含有PCR引物及正確的酶切位點(diǎn);第2位和第96位含有維持抗體結(jié)構(gòu)所必需的半胱氨酸,而且位置正確;其框架區(qū)與發(fā)表的小鼠VH序列有70%以上的同源性,并符合鼠VH的結(jié)構(gòu)特征;所克隆的VH基因可編碼118個(gè)氨基酸(3、4)。32B12F6VH基因核苷酸序

12、列放射自顯影分析AB:VH ForwardCD:VH Reverse4 2B12F6VH基因核苷酸序列與相應(yīng)氨基酸序列(PCR引物,CDR區(qū)用下劃線標(biāo)出)3 討 論基因工程抗體的研究已涉及醫(yī)學(xué)界多個(gè)學(xué)科,如應(yīng)用鼠人嵌合抗體對(duì)阻斷乙肝母嬰傳播及在意外感染時(shí)被動(dòng)免疫6的研究以及抗腎綜合征出血熱病毒基因工程抗體的研究7等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的PCR引物的5'端引物相應(yīng)于鼠Ig重鏈保守的第一框架區(qū)(FR1)N末端核苷酸序列,而3'端引物與J區(qū)序列互補(bǔ),引物兩端含有限制性內(nèi)切酶Pst和Bste,可方便地將克隆的VH基因切下并克隆到含小鼠Ig啟動(dòng)子及前導(dǎo)序列的載體中,以便在真核系統(tǒng)中表達(dá)。2B12

13、F6單抗VH基因經(jīng)序列分析表明該VH基因和Kabat抗體基因庫中小鼠抗體重鏈(A)組有較高的同源性。綜上所述,所獲得的2B12F6VH基因是完整的具有功能性的,這為構(gòu)建各種基因工程抗體和進(jìn)一步用于免疫防齲途徑的探討奠定了基礎(chǔ)。作者單位:(文立亞)100091 北京市海淀區(qū)黑山滬總后309醫(yī)院口腔科,(閆 巖,尹 文,吳興安,姜紹淳,馬文煜) 西安市第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室參考文獻(xiàn)1Lehner T, Caldwell J, Smith R. Local passive immunization by monoclonal antibodies against Streptococcal an

14、tigen / in the prevention of dental caries. Infect Immun. 1985, 50(3):7967992文立亞,岳松齡.單克隆抗體對(duì)變鏈球菌粘附的影響.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,1995,5(10):9103董志偉,王 琰.基因工程抗體.生物工程進(jìn)展,1992,增刊:53584Cowley JVC, Coloma MJ, Vazquez J, et al. Sepecific amplification of rearanged immunoglobulin variable region genes from mouse hybridoma cells. Hybridoma, 1990, 9(5):4074175Burne A, Chen YM, Penders JEC. Analysis of gene expressio