實(shí)驗(yàn)六苯硫脲嘗味的群體遺傳學(xué)調(diào)查

1、實(shí)驗(yàn)六 苯硫脲嘗味的群體遺傳學(xué)調(diào)查一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 測(cè)定人群中 PTC嘗味基因的表現(xiàn)型和基因型，理解孟德?tīng)栠z傳基因型與表現(xiàn)型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。2. 了解酶切擴(kuò)增多態(tài)序列（又稱為PCR-RFLP技術(shù)的原理，學(xué)會(huì)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)單核 苷酸多態(tài)性（SNPS。在分子水平上測(cè)定PTC嘗味的基因型。二、實(shí)驗(yàn)原理苯硫脲（phenylthiocarbamide , PTC是硫脲的苯基衍生物，為白色結(jié)晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能團(tuán)而有苦澀味。能?chē)L出 1/750,000-1/50,000 PTC濃度溶液 味道的人（苦澀味，少數(shù)人感到甜味）稱為苯硫脲“嘗味者”，只能?chē)L出PTC濃度大于1/24,00

2、0 溶液的味道的人稱為苯硫脲“味盲者（non taster ） ”。PTC嘗味能力是受單基因控制的孟德?tīng)栠z傳性狀，是由位于7號(hào)染色體上的一種苦味味覺(jué)感受器基因 TAS2R38決定的，屬于常染色體不完全顯性遺傳。嘗味者中顯性基因T的純合子（TT）能?chē)L出1/750,000-1 /6,000,000 的PTC溶液的苦味，雜合子（Tt）只能 嘗出1 /480,000-1 /380,000的PTC溶液的苦味。人類的PTC嘗味基因又名 PTC、T2R38或T2R61。絕大多數(shù)嘗味者與味盲者的區(qū)別在于三處單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms , SNPs）: 一處是

3、145位，味盲者為G145 （編碼丙氨酸ala ），嘗味者為C145 （編碼脯氨酸pro ）;第二處是785位， 味盲者為T(mén)785 （編碼纈氨酸 val ）,嘗味者為C785 （編碼丙氨酸 ala ）;第三處 在886位， 味盲者為A886 （編碼異亮氨酸ile ）,嘗味者為G886（編碼纈氨酸 val ）。因此味盲者PTC 多肽中三處對(duì)應(yīng)的氨基酸分別是ala49、val262和ile262 ,被稱為AVI等位基因，而嘗味者的三處是 pro49、ala262 和val262，被稱為PAV等位基因。如圖1所示。三個(gè)生NP位點(diǎn)；SNP1SNP2SNP3等位基因味自者GCACTGTTGCATCCTg

4、m5 (a la45)j 795(val®2)AVI嘗味者C14£ (pro)C795 (ala)(val)PAVCCACTGTGCGTCCTFnu4Hl識(shí)別位點(diǎn)（識(shí)別序列5'-GC,NGC-3圖1 PTC 嘗味基因上的三個(gè) SNP位點(diǎn)味盲者的PTC編碼區(qū)有五個(gè)限制性內(nèi)切酶Fn u4H1的識(shí)別位點(diǎn)（識(shí)別序列5' -GQ NGC3 ），如果是嘗味者，則其第 785位SNP恰好形成了一個(gè)額外的 Fnu4H1識(shí) 別位點(diǎn)（GCTG） 因此可以利用這個(gè) SNP造成的限制性位點(diǎn)多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含 785位SNP位點(diǎn)的PTC Fnu4H1基因編碼區(qū)的一部分，然后用F

5、nu4H1切割擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否能把擴(kuò)增產(chǎn)物切開(kāi)而判定是某個(gè)人的單倍型（haplotype）。如圖2所示。BDUDOgur t gg.ic tflzzoetgt Lcctgj g t g c l t c c24Dgcltdcccaicgc t c c J ii giioI ccc a g t flic t cc 1 ggg 1 a3fi0ettcctgcatcifGLJ榊 |c t gflic t th g c|e t gee tgcactgtcctc t fllg 11lgg上游引物gcagacctca ctlcecagtcJ t C l C J . E&40ctgctjtclg70

6、0720ccMO760c： t c g t g i c c cCHI右七g帥卩多態(tài)位點(diǎn)gee t下遊引物匕克t|t g g自g t曲t gseot C a t t9 tcc cFnuH/r9 qcatg g g c t c ggtHagagcco ac cacaagg cNP多態(tài)位點(diǎn)t c c t g t c 11: g g c a a t g c c a g l:900圖2味盲者PTC嘗味基因編碼區(qū)序列、實(shí)驗(yàn)用品1. 人口腔上皮細(xì)胞總 DNA引物I和n (20M)、TaqDNA聚合酶(5U/卩I )、10X PCR 反應(yīng)緩沖液、dNTP( 2.5mM)、滅菌蒸餾水、限制性內(nèi)切酶 Fnu4H1

7、( 20U/卩I )、10X酶切 緩沖液。2. 2%的瓊脂糖凝膠、1 xTAE 6X上樣緩沖液、DNA Marker、Goldview染料。3. PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、 微量加樣器(5卩l(xiāng)、20卩l(xiāng)、200卩)、槍頭(20卩、1200卩) 及離心管(1 ml、0.5 ml)、容器盒、恒溫水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、燒杯、保鮮膜、封口膜、微波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、托盤(pán)天平、臺(tái)式高速離心機(jī)。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 口腔上皮細(xì)胞總DNA的提取(1 )每實(shí)驗(yàn)小組選取1名受試者，用滅菌牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞。(2) 在1.5 ml滅菌微量離心管中加入100丄 滅菌水。(3) 受試者用無(wú)菌牙簽輕刮口

8、腔腮內(nèi)側(cè)，刮下來(lái)的細(xì)胞在滅菌水中漂洗。(4) 渦旋振蕩器渦旋振蕩混勻10 s。(5 )離心機(jī)瞬時(shí)離心 10 s。(6) 沸水浴中煮沸5 min。(7) 離心機(jī) 13200rpm 離心 2 min。(8) 基因組DNA 4 C保存?zhèn)溆谩?. PCR擴(kuò)增PTC基因片段，反應(yīng)體系如下：ddHiO12.51lOxPCR緩沖液2.51dNTP Q 一如 M)2.Op!弓 I物 1(20gM)0.5譏弓 |物 2(20gM)0.5ulr"-TaqE C>U pl)0.15pl模板DNA2.Qul2(M上游引物：hPTC Forward 5 '-aactggcagaataaagatc

9、tcaatttat3'下游引物：hPTC Reverse 5'-aacacaaaccatcacccctatttt-3'按以上次序，將各物質(zhì)加入到一只無(wú)菌的 0.2 ml離心管中。輕輕混勻后，離心 5秒鐘，加入一滴液體石蠟蓋于反應(yīng)混合液的表面，然后放入PCR儀中進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序如下：94 C 5min（預(yù)變性）-94 C 30s（變性）-55 C 30s（退火）-72 C 30s（延伸）-step 1 step 2 step 3 step 472C 10min（ 延伸 ）-4 C 保存step 5 step 6其中從step2到step4循環(huán)40次，PCR產(chǎn)物

10、總長(zhǎng)303bp，反應(yīng)結(jié)束后置 4C冰箱保存。3. PCR 產(chǎn)物的 Fnu4H1 酶切反應(yīng)體系15卩其成分如下：PCR產(chǎn)物 6 卩IFnu4H1 （10U/ 卩 I）1 卩 I10X酶切緩沖液2 卩l(xiāng)無(wú)菌水6l置37 C水浴消化1小時(shí)，4 C保存4. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（ 1 ）膠板的準(zhǔn)備 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（注意， 將透明膠帶緊貼于有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置，在距離底板 0.51.0 ml 的位置放入梳子。（ 2） 2%的瓊脂糖凝膠的制備稱取1克瓊脂糖，置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入50ml 1X TAE,瓶口用保鮮膜封

11、蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到2%瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65 C左右，加入2.5 11溴化乙啶貯存液（10mg/ml）,使溴化乙啶終濃度為0.5卩g/m。小心混勻并倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開(kāi)，避免產(chǎn)生氣泡，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形 成均勻的膠層。室溫下靜置 1 小時(shí)左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形 成相互隔開(kāi)的樣品槽。（3） 將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒(méi)過(guò)膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)電泳 10min 。（4） 每份限制酶切產(chǎn)物取10 1,加2 116X上樣緩沖液，混勻后加入到樣品孔中，以 100V 電泳 50 分鐘。（5 ）斷電后取出凝膠，放在紫外透射儀中觀察并記錄PCR-RFLP結(jié)果。電泳結(jié)果中基因型為 TT 的嘗味者能夠出現(xiàn) 2 條酶切條帶， 基因型為 Tt 的嘗味者能夠出現(xiàn)Marker PCR/Fnu4HlPCRtt Tt TTTT233 bP