菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、.菌種管理制度1、目的 建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2、適用范圍 本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義 Ø 標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。Ø 傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。Ø 工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。Ø 菌種的代是

2、指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4、職責(zé)4.1部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1菌種的申購部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計(jì)劃（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要），填寫申購流程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或傳代用菌種，購買時(shí)，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2菌種的接收菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，由部門主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在標(biāo)準(zhǔn)菌株庫存記錄上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量

3、、編號（無編號者按檢定菌種的編號原則編號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于48冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3菌種的保存5.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至48冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類而不同，細(xì)菌：每個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞：36個(gè)月轉(zhuǎn)種一次；絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種一次。5.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。5.3.2.1甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)

4、溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在-30冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）。可以每隔2年轉(zhuǎn)種一代。使用時(shí)，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。5.3.2.2液體石蠟保存法5.3.2.2.1無菌液體石蠟的制備：

5、選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121滅菌30分鐘,置40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。5.3.2.2.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20冷凍或28冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表1 傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌C

6、MCC(B)44102甘油冷凍管-302年金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104）枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-81年黑曲霉菌CMCC(F)980035.4菌種的處理和保藏5.4.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代5.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇5.4.1.1.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。5.4.1.1.2培養(yǎng)基Ø 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；Ø 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；Ø

7、; 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；Ø 改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a) 在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b) 用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時(shí)必須小心，因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂）。c) 以無菌方法用一無菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安瓿中。d) 輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e) 用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相

8、應(yīng)的液體培養(yǎng)基。f) 根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)1824小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度2328，培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)蘇生長；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間至7天，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。g) 若黑曲霉為菌懸液，則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328培養(yǎng)57天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h) 取經(jīng)復(fù)蘇

9、后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按f）項(xiàng)操作對菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無菌甘油混勻，12ml/管，分裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)，其余作為儲(chǔ)備管在-30冷凍條件下保存。黑曲霉按g）項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種菌懸液中12ml/管加石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于-20冷凍或28冰箱中保存。制備10支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。將上述制備好的

10、凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號、編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。i) 儲(chǔ)備菌種管制備成功，儲(chǔ)存于30，有效期為兩年。5.4.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)a) 用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基（細(xì)菌）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長的鑒別培養(yǎng)基平板上。b) 然后在3035下培養(yǎng)3天（細(xì)菌）；2025下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。c) 培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，每種菌劃4個(gè)平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落，進(jìn)行保存和鑒定。d) 鑒定時(shí)作

11、革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。必要時(shí)再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步鑒定該菌種。e)  若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。f) 菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在菌種鑒定記錄上。g) 各菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（2）。5.4.1.3菌種的傳代5.4.1.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代a) 按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，分離單個(gè)純種菌落，此為第2代（G2）。b) 菌

12、種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管或液體石蠟管，作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。c) 將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用于日常檢驗(yàn)。d) 取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上。平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用菌種，此仍為第3代（W3）。e) 將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。f) 按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止

13、，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。g) 當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。5.4.1.3.2傳代用菌的傳代將購回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)日常檢驗(yàn)工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種(為第4代)，同時(shí)，結(jié)合菌種的代數(shù)和最長保存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“5.3.2”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。5.4.1.3.2.1傳代用菌的傳代操作步驟Ø 從冰箱冷藏室（28）中取出菌種斜面后，應(yīng)溫室放置約30min。Ø 將裝有新鮮配

14、制的培養(yǎng)基和傳代菌種一并移入生物安全柜內(nèi)，打開紫外燈照射1小時(shí)。Ø 關(guān)閉紫外燈。酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種環(huán)，將接種環(huán)燒紅約30s，5.4.1.3.2工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱48保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔⑿聜鞔呐囵B(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌種，進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每1個(gè)月傳代一次；酵母菌每2個(gè)月傳代一次；霉菌及芽胞每3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過5代，須用傳代用菌種傳代。5.4.4注意事項(xiàng)：傳代時(shí)注

15、意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員也要采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作時(shí)必須穿工作服，佩帶無菌手套，實(shí)驗(yàn)完成以后消毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢驗(yàn)人員應(yīng)立即向部門主管報(bào)告以便及時(shí)進(jìn)行處理。5.4.5傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括：名稱、編號、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交部門主管統(tǒng)一保管。同時(shí)及時(shí)填寫菌種傳代記錄（附表2）。5.5檢定菌種的編號采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母代次傳代日期順序號 菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯

16、草芽孢桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如：2015年1月12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號為E.c-G3-120112-01。5.6檢定菌種的保管5.6.1檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管，并對所保存的菌種建立檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬（附表3）。5.6.2檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保存期間，工作日應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度、必要時(shí)檢查菌種管

17、的塞子是否松動(dòng)，是否染雜菌等，并及時(shí)填寫檢定菌種觀察記錄（附表4），如有異常應(yīng)及時(shí)處理。菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個(gè)月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)，必要時(shí)檢查生化特性等項(xiàng)目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定菌種鑒定記錄（附表5）。5.6.3所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個(gè)人，需要時(shí)應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可供應(yīng)。5.7檢定菌種的使用5.7.1微生物學(xué)檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)需要，需到部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，同時(shí)填寫檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬。5.7.2微生物學(xué)檢驗(yàn)人員從部門主管領(lǐng)

18、取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗(yàn)或驗(yàn)證試驗(yàn)，使用后及時(shí)填寫檢定菌種使用登記臺(tái)賬（附表6），以便追蹤菌種使用歷史。5.7.3菌液的制備：將新鮮的斜面菌種培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10-100cfu/ml的菌懸液，置于04冰箱冷藏，用于陽性對照實(shí)驗(yàn)，使用期24h，濃菌液放冰箱可保存一周。5.8檢定菌種（廢棄）的銷毀5.8.1下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121、45分鐘濕熱滅活處理：a、新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b、使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌株的器具和培養(yǎng)物；c、超過有效期的菌種；d、凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；e、其他應(yīng)廢棄的菌種。

19、5.8.2廢棄菌種的銷毀由微生物檢驗(yàn)員提出申請，交部門主管批準(zhǔn)后，進(jìn)行滅活處理，并有其他人在場監(jiān)督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄（附表7）。6、相關(guān)文件：初始污染菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、純化水檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、中國藥典標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等。7、注意事項(xiàng)：8.1、微生物檢驗(yàn)人員最好生物相關(guān)專業(yè)，要經(jīng)過培訓(xùn)，取證上崗。8.2、購買菌種要保留相關(guān)證明，最好讓藥檢所開個(gè)證明，說明購買菌種的名稱、菌種代數(shù)、數(shù)量等，把這個(gè)證明附在菌種接受記錄后。8.3、菌種的傳代、使用在陽性操作間，為保護(hù)菌種和人員，最好使用生物安全柜。8.4、菌種常用的是10-100cfu/ml的菌懸液，可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定制備方法。如果是細(xì)

20、菌：可參照麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行估算。從孵育18-24小時(shí)的非選擇性培養(yǎng)基上，挑取3-5個(gè)菌落，直接用肉湯或鹽制成懸液作為接種，一般將濁度調(diào)整至麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管10號對應(yīng)濃度，然后稀釋。麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒ǎ?.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2 2H2O) 、0.36NH2SO4(1%V/V)將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存，用前混勻。有效期為6個(gè)月。應(yīng)用時(shí)，可目測或使用比濁儀即可。 0號管對應(yīng)的菌濃度為30×108cfu/ml，稀釋一般用無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）。8、附表附表1：檢定菌接收記錄附表2：檢定菌種傳代記錄附表3：檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表4：檢定菌種觀察記錄附表5：檢定菌種鑒定記錄附表6：檢定菌種使用登記臺(tái)賬 附表7：廢棄菌種（物品）銷毀處理記