藻類葉綠素a的測(cè)定

1、藻類葉綠素a的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)名稱藻類葉綠素a的測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?水)環(huán)境化學(xué)中葉綠素a測(cè)定意義在地表水環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)化的研究中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的最常用的指標(biāo)之一。同時(shí)，葉綠素a也是用來(lái)衡量水體水質(zhì)，評(píng)價(jià)水體富營(yíng)養(yǎng)化水平的標(biāo)準(zhǔn)之一。三、 實(shí)驗(yàn)原理葉綠素介紹葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。所有光合器官中都含有葉綠素。葉綠素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，難溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙紅光和藍(lán)光。因此，這兩種光對(duì)光合作用最有效。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來(lái)，游離葉綠素不很穩(wěn)定，光、熱、酸、堿、氧、氧化劑等都會(huì)使其分解。在酸性條件下，葉綠素

2、中的鎂原子很容易被其他酸代替，綠色消失而變黃，葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，加熱時(shí)反應(yīng)加速。葉綠素的實(shí)驗(yàn)室測(cè)量方法有分光光度法、熒光法、色譜法，其中以傳統(tǒng)的分光光度法應(yīng)用最為廣泛。根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：A =CL式中：為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分比濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混

3、合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。（1）單色法已知葉綠素a的80丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm，已知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04，因此CA=A663/82，可以計(jì)算出葉綠素a的含量(mg/L)。（2）三色法已知葉綠素a、b的80丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm 和645nm，且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測(cè)定提取液在645nm、663nm、652nm 波長(zhǎng)下的吸光值，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式便可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。已知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶

4、液中的比吸收系數(shù)分別為82.04 和9.27，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式： A663=82.04Ca +9.27Cb(1) A645=16.75Ca+45.6Cb(2) 式中A663、A664分別為波長(zhǎng)663nm和645nm處測(cè)定葉綠素溶液的吸光度值；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(g/L)。 解聯(lián)立方程(1)、(2)可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645(3)Cb=0.0229A645-0.00468A663(4)如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，(3)、(4)式則可改寫為： Ca(mg/L)=12.7

5、A663-2.69A645(5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663(6)葉綠素總量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663(7)葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo) A652=34.5×CT由于652nm為葉綠素a與b在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(diǎn)(等吸收點(diǎn))，兩者有相同的比吸收系數(shù)(均為34.5)，因此也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度(A652)求出葉綠素總量： CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652×1000/34.5(8)因此，可利用(5)、(6)式可分別計(jì)算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(8)式可計(jì)算葉綠素總量。從

6、上可見(jiàn)，葉綠素提取后測(cè)定又可以分為兩種：?jiǎn)紊?663nm)與三色法(645nm、663nm、652nm)。具體使用單色法還是三色法將依據(jù)測(cè)定對(duì)象而定。在標(biāo)準(zhǔn)方法、超聲波法、反復(fù)凍融法、延時(shí)提取法、熱丙酮法、丙酮加熱法、熱乙醇法、混合溶劑法等多種常見(jiàn)浮游植物葉綠素a測(cè)定方法中，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻（Microcystis aeruginosa）水華樣品為研究對(duì)象進(jìn)行的葉綠素a含量測(cè)定。不管是從葉綠素a提取的完全性、測(cè)定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)便性考慮等方面來(lái)看，包括國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法在內(nèi)的大多數(shù)方法，存在操作耗時(shí)長(zhǎng)、過(guò)程復(fù)雜、葉綠素提取不完全的缺點(diǎn)；而以丙酮加熱法測(cè)量葉綠素a的提取效率高、數(shù)據(jù)穩(wěn)

7、定性好，操作耗時(shí)短、簡(jiǎn)便，可推薦作為一種常用的浮游植物葉綠素a的測(cè)量方法，尤其是應(yīng)急監(jiān)測(cè)或大批量水環(huán)境樣品測(cè)定時(shí)更顯現(xiàn)優(yōu)勢(shì)(表1)。表1 不同提取方法實(shí)驗(yàn)耗時(shí)情況測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)方法延時(shí)提取法熱丙酮法反復(fù)凍融法超聲提取法丙酮加熱法熱乙醇法混合溶劑法/(µg·L-1)0.9741.0111.2161.4351.5171.6351.0261.397標(biāo)準(zhǔn)方差0.1490.1630.1570.0640.2530.0720.0770.126變異系數(shù)15.716.014.73.9116.53.265.249.42實(shí)驗(yàn)耗時(shí)/h8-8.57-7.59-9.524211.5-28-98-9丙酮加

8、熱法測(cè)定的注意事項(xiàng)：隨著水浴加熱過(guò)程溫度的升高，丙酮的萃取能力得到增強(qiáng)，而且提取過(guò)程耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，樣品基本沒(méi)有損失。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，加熱的時(shí)間與溫度控制很重要，且需要采取避光措施。溫度過(guò)高、有光照條件以及加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，均可能破壞葉綠素a的穩(wěn)定性。四、材料、儀器設(shè)備及試劑 材料：待測(cè)浮游藻；本實(shí)驗(yàn)采用藍(lán)藻產(chǎn)毒銅綠微囊藻（左）與綠藻蛋白核小球藻（右）。 儀器設(shè)備：5mL或1mL移液槍、5mL或1mL槍頭、10mL離心管、離心機(jī)、錫箔紙、水浴鍋、溫度計(jì)、10mL刻度試管、比色皿、分光光度計(jì)。試劑：80丙酮。 五、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)一、確定藻密度的藍(lán)藻藻液。用移液槍吸取2mL藍(lán)藻液置于10mL離心管中，

9、于12000rpm離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55ºC水浴放置30min，后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測(cè)定663nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照CA=OD663/82，計(jì)算出葉綠素的含量(mg/L)。實(shí)驗(yàn)二、確定藻密度的綠藻藻液。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55ºC水

10、浴放置60min，后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測(cè)定663nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照CA=A663/82，計(jì)算出葉綠素a的含量(mg/L)。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL 80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55ºC水浴放置30min，后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測(cè)定663nm、645nm、652nm處的光吸收值，測(cè)定結(jié)果按照三色法

11、公式，可計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素的含量(mg/L)。根據(jù)下式，計(jì)算出原藻液中各葉綠素的含量(mg/L)：根據(jù)下式，計(jì)算出不同藻液中單個(gè)細(xì)胞各葉綠素的含量(g/個(gè)細(xì)胞)：六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理在不同波長(zhǎng)下分別測(cè)藍(lán)藻和綠藻的吸光度，數(shù)據(jù)記錄如下表：663nm645nm652nm藍(lán)藻0.772綠藻0.0520.0290.039對(duì)藍(lán)藻的葉綠素計(jì)算用公式CA=OD663/82，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)下表45.6對(duì)綠藻的葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素分別用公式：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663CT(mg/L)=A652×1000/34

12、.5計(jì)算結(jié)果如下表：葉綠素a（mg/L）葉綠素b（mg/L）總?cè)~綠素（mg/L）藍(lán)藻0.00940.0094綠藻（三色法）0.58240.42071.0031綠藻（單色法）0.63410.63601.2701 根據(jù)下式，計(jì)算出原藍(lán)藻和綠藻溶液中各葉綠素的含量(mg/L)：結(jié)果見(jiàn)下表：葉綠素a（mg/L）葉綠素b（mg/L）總?cè)~綠素（mg/L）藍(lán)藻0.02350.0235綠藻1.45601.05182.5078 根據(jù)下式，計(jì)算出藍(lán)藻和綠藻中單個(gè)細(xì)胞各葉綠素的含量(g/個(gè)細(xì)胞)：藍(lán)藻藻液密度為3.3x107個(gè)/mL，即每毫升藍(lán)藻藻液中含有3.3x107個(gè)藍(lán)藻細(xì)胞。綠藻藻液密度為8.4x107個(gè)/m

13、L，即每毫升綠藻藻液中含有8.4x107個(gè)綠藻細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)下表：葉綠素a（g/細(xì)胞）葉綠素b（g/細(xì)胞）總?cè)~綠素（g/細(xì)胞）藍(lán)藻7.1x10-137.1x10-13綠藻1.735x10-111.252x10-112.987x10-11七、 結(jié)果與討論（1）請(qǐng)說(shuō)明藍(lán)藻只采用單色法測(cè)定葉綠素的原因。單色分光光度法測(cè)定葉綠素含量時(shí)，要測(cè)定665和750nm處的吸光度。藍(lán)藻只含有葉綠素a，不含有葉綠素b，所以只采用單色法測(cè)定葉綠素。（2）請(qǐng)比較綠藻單色法與三色法測(cè)定結(jié)果的差異，并說(shuō)明理由。從單色法與三色法的測(cè)定結(jié)果比較得出，一般單色法測(cè)定的Chl-a的數(shù)值要高于三色法。因?yàn)椋瑔紊ㄓ?jì)算所得的葉綠素a的含量是在663nm處所有吸光的葉綠素含量，不僅僅包括葉綠素a，還有部分葉綠素b，而三色法計(jì)算所得的葉綠素a減去了在663nm處吸光的葉綠素