微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ，（）： ： ：微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化孫 倩王喜平閆巧娟江正強（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 ，北 京 ；中 國農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院 ，北 京 ）摘 要 篩選得到一株高產(chǎn)凝乳酶的菌株 ，鑒 定為微孢根霉。通過單因素試驗優(yōu)化了微孢根霉 液體發(fā) 酵產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件。結(jié)果 表 明 ：發(fā) 酵 產(chǎn) 酶 的 最 適 碳 源 為 酒 糟 ，最 適 氮 源 為 酵 母 浸 粉 ，培 養(yǎng) 基 最 適 初 始 為 。在 優(yōu)化后的發(fā)酵條件下 培 養(yǎng) ，微 孢 根 霉 產(chǎn) 凝 乳 酶 活 性 最 高 ，達(dá) 到 。 微 孢 根 霉 在 凝乳酶生產(chǎn)方面有很大的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞 微孢根霉 ；

2、凝 乳酶 ；液 體發(fā)酵 ；優(yōu) 化中圖分類號 文章編號 （） 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 ，（，；，） ， ：， ， ， ；凝乳酶是一種天冬氨酸蛋白酶 ，特 異性地水解 酪蛋白 之間 的肽鍵，導(dǎo) 致牛奶凝結(jié)， 因此廣泛用于奶酪與干酪素生產(chǎn)中。傳統(tǒng)的凝乳酶 來源于小牛皺胃，但利用其生產(chǎn)干 酪受到很大的限 制。微生物生產(chǎn)凝乳酶成本較低 、酶提取方便、經(jīng)濟(jì) 效益高，不僅解決了小牛皺胃酶供不應(yīng)求的問題 ，而 且?guī)恿四槊钢苿┬袠I(yè)的發(fā)展。微生物凝乳酶的 來源有細(xì)菌、放線菌和真菌，其中細(xì)菌中的解淀粉芽 孢桿菌和枯草芽孢桿菌都有產(chǎn)凝乳酶的報道，也 有學(xué)者篩選到放線菌中鏈霉菌屬 、小單孢菌屬和馬 杜拉放線菌屬都有一定的產(chǎn)凝乳

3、酶活性，其 蛋白 水解活性也很高，但酶的熱穩(wěn)定性較高，不適合單獨 用于奶酪生產(chǎn)。一些真菌產(chǎn)凝乳酶性質(zhì)適合于奶酪 生產(chǎn)，毛霉屬和根 毛霉屬是研究最為廣泛的產(chǎn)凝乳 酶的種屬，近年來 有關(guān)根霉屬菌株產(chǎn)凝乳酶的報道 也比較多。真菌來源的凝乳酶從 世紀(jì)年代即 開始用于商業(yè)化干酪的生產(chǎn)。 迄今，國 外已實現(xiàn)微 生物發(fā)酵凝乳酶的規(guī)?；a(chǎn)。目前微生物凝乳酶應(yīng)用最多的是真菌中的微小毛霉（）、 米 黑 毛 霉 （ ）和 栗 疫 菌 （收稿日期 ：基金項目：國家杰出青年科學(xué)基金項目（）第一 孫倩 ，博 士研究生 ，：通訊 江正強 ，教 授 ，博 士 ，主要從事酶工程專業(yè)研究 ，：中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報年

4、第 卷）產(chǎn)生 的 凝 乳 酶。 國 內(nèi) 學(xué) 者 自 世 紀(jì) 年代開展凝乳酶的研究 ，但 國內(nèi)大部分凝乳酶主 要還是依賴進(jìn)口的重組凝乳酶制劑 ，隨 著奶酪市場需求的不斷擴(kuò)大，凝乳酶的研究開 發(fā)仍然具有重要 的意義。相較于牛胃凝乳酶，一些微生物凝乳酶仍存在 凝乳活性較低、水 解酪蛋白的活性較高和熱穩(wěn)定性 高的問題，限制 其在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用。 但微生物 源凝乳酶是新型凝乳酶開發(fā)的一個有效途徑 ，凝 乳 酶高產(chǎn)菌株的篩選仍是關(guān)鍵 ，同時 對酶的發(fā)酵工藝 進(jìn)行優(yōu)化以提高酶的產(chǎn)量，對今后酶性質(zhì)的研究及 其工業(yè)化生產(chǎn)都極為重要。微生物凝乳酶生產(chǎn)的發(fā) 酵方式有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。很多真菌凝乳酶用 固體發(fā)酵，

5、但固體發(fā)酵是間歇式發(fā) 酵 ，培 養(yǎng)基 和溶氧等條件不易控制，且有些微生物固體發(fā)酵的產(chǎn) 酶活性并沒有液體發(fā)酵高。根霉可作為凝乳酶的潛在產(chǎn)生菌 ，具 有在奶酪 生產(chǎn)中應(yīng)用的潛力，研究根霉凝乳 酶以替代小牛皺 胃酶生產(chǎn)干酪具有重要的意義。本實驗室篩選得到 一株 高 產(chǎn) 凝 乳酶的微孢根霉須狀變 種 （）。 國 內(nèi) 外 學(xué) 者的研究表明微孢根霉可產(chǎn)生纖維素酶和 脂肪酶等，但未見其產(chǎn) 生凝乳酶的報道。 本研究通過對此 菌株產(chǎn)凝乳酶液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化 ，旨 在為其應(yīng) 用于奶酪等相關(guān)產(chǎn)業(yè)提供依據(jù)。 材料與方法 材料菌株 ，由中國農(nóng)業(yè)大 學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院食蛋白胨 ，磷 酸二氫鉀 ，無 水氯化鈣 ，硫

6、 酸 鎂， 為。發(fā)酵培養(yǎng)：在 培養(yǎng)，發(fā)酵液離心取上 清，測定粗酶液凝乳酶活性和蛋白水解活性 。 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化利用單因素法優(yōu)化微孢根霉 液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的條件。分別以質(zhì)量濃度為 的麩皮、 燕麥、酒糟、脫脂棉 粉和蔗渣為單一碳源 ，酒 糟與葡 萄糖、蔗糖和脫脂棉等按照 的比例進(jìn)行復(fù)配做 復(fù)合碳源，考察 碳源對產(chǎn)酶的影響。 選取最適的碳 源，研究碳源濃度對產(chǎn)酶的影響 。選定碳源后，以每 種氮源含氮素 （ 的蛋白胨所含的 氮素）為基準(zhǔn)，研究氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、 酵母浸粉、酪蛋白、脫 脂粉、大 豆蛋白胨和大豆粉等 氮源對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響。 選定氮源 種類后，研究氮 源濃度對產(chǎn)酶

7、的影響。 選取最適碳 源和氮源，對二者濃度設(shè)計因素水平正交試驗， 確定最佳碳氮比。確定最佳碳源和氮源后 ，試 驗同樣采用單因素 優(yōu)化的方法對微孢根霉 液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的 培養(yǎng)條件包括 初 始 、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間進(jìn)行 優(yōu)化研究。分別在不同初始 （）和 不同 溫度（ ）下 發(fā) 酵 產(chǎn) 凝 乳 酶 以 考 察 初 始 和溫度對產(chǎn)酶的影響 ；最 后在優(yōu)化后的最適培養(yǎng)條 件下培養(yǎng)菌株，考察產(chǎn)酶歷程，確定最適發(fā)酵時間。 試驗數(shù)據(jù)采 用 軟 件 進(jìn) 行 分 析，試 驗 中 各發(fā)酵條件的優(yōu)化均做 次平行，結(jié) 果取 次結(jié)果的 平均值。 酶活性及蛋白含量的測定，以 牛 血 清 蛋 白品 酶 與 發(fā) 酵 工 程

8、實 驗 室 篩 選 保 存。 酪 蛋 白（），購 于 公 司；低 分 子 量 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 樣總蛋 白 含 量 測 定： 法為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。品，購于 公司；酵母提取物、胰蛋白胨，購于凝乳酶活性測定：用 ， 的英國 公司；其他試劑均為分析純 。 方法 菌株鑒定培養(yǎng)菌株，觀 察菌落形態(tài)。 用掃描電子 顯微鏡觀察孢子表面結(jié)構(gòu)。 提取微孢根霉 的 基因組 ，測 定 序 列 并 在 中進(jìn)行 比 對，使 用 軟 件 構(gòu) 件 系 統(tǒng) 發(fā)育樹。 液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶初始發(fā)酵培養(yǎng)基 （質(zhì) 量 濃 度，）：燕 麥 粉 ，醋酸鈉緩沖液配制質(zhì)量濃度為 的脫脂乳液，氯化鈣濃度為。取 脫脂乳液于 保溫 ，加 入 酶 液，立 即

9、 混 勻，開 始計時，當(dāng)管壁上出現(xiàn)絮 狀沉淀時即為終點。 把 凝固 質(zhì)量濃度為 脫脂乳液所需的 酶量定義為 一 個 索 氏 單 位 （ ，）。 按下式計 算 凝 乳 酶 活 性 為 × ×（× ）。式中： 為凝乳酶活 性（）； 為脫 脂牛奶溶液體積； 為加酶體 積；為 凝乳 時間； 為稀釋倍數(shù)。第 期孫倩等：微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化 結(jié)果與分析 菌株鑒定真菌 的 的 序 列 全 長 為 ，序列比對結(jié)果 表明該菌株與根霉屬菌株的同源 性很高。利用軟件 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如 圖 所 示， 與 根 霉 屬 的 微 孢 根 霉 （）之間親緣關(guān)系最為接近。圖 系 統(tǒng)發(fā)育

10、樹 真 菌 在 培 養(yǎng) 的 菌 落 形 態(tài) 見 圖 （），白 色 匍 匐 菌 絲 不 發(fā) 達(dá) ，先 有 少 量 頂 蓋 生 長 ， 后 塌 陷 。 在 掃 描 電 鏡 下 觀 察 其 產(chǎn) 孢 結(jié) 構(gòu) ，見 圖 （），孢子囊軸大多呈梨形 ，少 數(shù) 呈 半 球 形 球 形 ，屬 于根霉屬中的微 孢根 霉 （）。子 囊 孢 子 呈 球 形 ，表面有細(xì)刺狀突 起 。 參 照 等 對 該 屬 菌 株 分 類 檢 索 表的修正及對微 孢 根 霉 變 種 分 類 學(xué) 特 征 的 描 述 ，鑒 定 該 菌 株 為 微 孢 根 霉 須 狀 變 種 （）。圖 的菌落形態(tài)和電鏡下孢子形態(tài) （）（） 碳源對菌株液體發(fā)

11、酵產(chǎn)凝乳酶的影響碳源對微孢根霉 發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響見 表。當(dāng)以酒糟和脫脂棉粉作為唯一碳 源 時，微 孢 根霉 發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶能力較高，其 中 又 以 利 用酒糟的能力最強，凝乳酶活 性達(dá)到 。 這 可能是由于酒糟本身含氮素豐富 ，而 凝乳酶是一種 誘導(dǎo)酶，酒糟既作為碳源又作為誘導(dǎo)劑 ，有利于微孢 根霉 凝乳酶的分泌。試 驗進(jìn)一步研究了酒糟中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報年 第 卷表 碳源種類對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 質(zhì)量濃度的增加，凝乳酶活性增加；當(dāng)酒糟質(zhì)量濃度 為 時，凝 乳 酶 活 性 最 高，為 ；而 后隨著酒糟濃度的增加 ，凝乳酶活性開始下降 。 因碳源種類凝乳酶活 性（）此選質(zhì)量濃度為

12、 的酒糟作為碳源。 麩皮 ±燕麥 ±酒糟 ±脫脂棉粉 ± 氮源對菌株液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響氮源對微孢根霉 發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響見 表。不同氮源 對 微 孢 根 霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 不同，其中以酵母浸粉為氮源產(chǎn)凝乳酶最高 ，活性為 。同 時 考 察 了 酵 母 浸 粉 濃 度 對 產(chǎn) 酶 的影響，結(jié)果 如 圖 。 試驗表明當(dāng)酵母浸粉 質(zhì) 量 濃 度 蔗 渣 ± 為時酶活 性 最 高，為；之 后，隨與葡萄糖、蔗糖、脫 脂棉、燕麥和淀粉的復(fù)配對產(chǎn)酶 的影響（表），結(jié)果表明 酒糟與蔗糖復(fù)配時，凝 乳酶 活性最高，為 ，反 而低于酒糟作為單 一 碳源時的酶

13、活性。因此選擇酒糟作為碳源。表 碳源復(fù)配對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 著酵母浸粉質(zhì)量濃度增大 ，酶活性逐漸下降 。 氮源 的類型和性質(zhì)影響酶的合成和分泌 ，酵 母浸粉營養(yǎng) 成分豐富，可為微生物發(fā)酵提供全面均衡的營養(yǎng) 。表 氮源種類對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 氮源種類凝乳酶活 性（）碳源種類凝乳酶活 性（）氯化銨 ±酒糟葡萄糖 ±酒糟蔗糖 ±硫酸銨 ±硝酸鉀 ±酒糟脫脂棉±蛋白胨 ±酵母浸粉 ±酒糟燕麥 ±酒糟淀粉 ±進(jìn)而研究了酒糟的質(zhì)量濃度 對微孢根 霉 產(chǎn)凝乳酶的影響，結(jié)果如圖。試 驗表明 ，隨

14、 著酒糟圖 酒糟質(zhì)量濃度對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 酪蛋白 ±脫脂粉 ±大豆蛋白胨 ±大豆粉 ±圖 酵母浸粉濃度對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 第 期孫倩等：微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化 最佳碳氮比的確定以酒糟為碳源，酵母浸粉 為氮源，設(shè) 計 因素 水平正交試驗，確定最佳碳氮比。 正交試驗因素和 水平及試驗方案和結(jié)果分析見表 。由表正交試驗結(jié)果分析表明 ，碳 源濃度對產(chǎn) 酶影響較氮源大，隨著碳源濃度增大，產(chǎn)酶量先升高后下降，而氮源 濃度對產(chǎn)酶量影響較小。 由極差分 析得，最優(yōu)組合為 ，經(jīng)驗證，此條件下得 凝乳酶 活性 為 ，高 于 其 他 試 驗 組，因

15、此 使 用 作為最佳碳源和氮源，即當(dāng)酒糟濃度為， 酵母浸粉濃度為 時，產(chǎn) 酶量最高，此 時碳氮 比為。表 碳源和氮源配比正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析 試驗號 酒糟質(zhì)量 濃 度（） 酵母浸粉質(zhì)量 濃 度（）（空 列）（空 列）凝乳酶活 性（）（）（）±（）±（）±（）±±±（）±±±均值 均值 均值 極差 主次順序 優(yōu)水平 優(yōu)組合 培養(yǎng)基 初 始 對 菌 株 液 體 發(fā) 酵 產(chǎn) 凝 乳 酶 的 影響隨著初始 的 升 高，發(fā) 酵 液 凝 乳 酶 活 性 增 大（表）。在初始 為時，培養(yǎng)基 維持在較 高酸度，不 利于

16、微孢根霉 產(chǎn)酶；當(dāng) 初始 大慢，影響凝乳酶活 性 ，因 此本試驗選擇 作為培 養(yǎng)溫度。表 培養(yǎng)基初始 對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 于時，酶活性不再增加，最高酶活為。 初始 過 高 或 過 低 都 會 使 微 生 物 的 生 命 活 動 減初始 凝乳酶活 性（）弱，代謝產(chǎn)物累積增加。 發(fā)酵溫度對菌株液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響在不同溫度下發(fā)酵微孢根霉 ，從 表 可以 看出， 以下時，隨著溫度升 高，凝乳酶活性也明 顯升高，溫度繼續(xù)上升，酶活性下 降， 時酶活性 下降至。 時達(dá)到最大值，凝 乳酶酶 活性為。 溫 度 是保證微生物生長和 產(chǎn) 酶的重要條 件 之 一，溫度過高或過低 ，菌 體 生 長 緩 &

17、#177;±±±±±±中 國 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報年 第 卷表 發(fā)酵溫度對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 性達(dá)，而蛋白產(chǎn)量反而 下降，可 能是發(fā) 酵液中的蛋白酶水解了發(fā)酵所產(chǎn)生的其他蛋白。 討論發(fā)酵溫 度凝乳酶活 性（）微 孢 根 霉 須 狀 變 種 （ ±±±±± 培養(yǎng)時間對菌株液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響確定各發(fā)酵條件的最優(yōu)參數(shù)后 ，在 最佳條件的 基礎(chǔ)上考察發(fā)酵時間對微孢根霉 液體發(fā)酵產(chǎn) 酶的影響。培養(yǎng)時間對微孢根霉 發(fā)酵產(chǎn)凝乳 酶的 影 響 見 圖 。 菌 株 在 優(yōu) 化 后 的 發(fā) 酵

18、 條 件 下， 即已開始產(chǎn)酶，發(fā)酵 時酶活性可達(dá) ，蛋白含量 為 。 之后，隨 著培 養(yǎng)時間的增加，酶活性增長緩慢，發(fā)酵時酶活圖 發(fā)酵時間對微孢根霉 產(chǎn)凝乳酶的影響 ）液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件 的研究表明該菌株能夠發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶。本研究采用單因素優(yōu)化法對微孢根霉 液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的條 件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)影響菌株生 長快慢及代謝方式 ，會 誘導(dǎo)或阻遏不同代謝產(chǎn)物的 合成，從而產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物種類 ，影響產(chǎn)物的產(chǎn) 量。對碳源、氮源和 培養(yǎng)基初始 、發(fā) 酵溫度等的 研究表明，該菌株利用酒糟作為碳源 ，酵母浸粉作為 氮源，在 ， 條件下產(chǎn)酶最高。 不同菌株 對營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況不同 ，國 內(nèi)外

19、學(xué)者對產(chǎn)凝乳 酶的菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化的研究中 ，利用葡萄糖、 酪蛋白等簡單底物和麩皮 、燕麥粉、大豆粉等復(fù)雜底 物時，產(chǎn)酶量有所不同 ，復(fù)合底物?？烧T導(dǎo)酶的大量 分泌。等對米黑根毛霉產(chǎn)凝乳酶研究 中， 利用麩皮作為底物 ，發(fā) 酵 后 酶 活 性 最 高。 丁 明 亮等采用液體發(fā)酵枯草 芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶 ，以 葡 萄糖為主要碳源時酶活性最高。國內(nèi)外有許多類似的真菌發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的研究（表），但 目 前，天然菌株篩選的凝乳酶活性都不 高，有報道顯示根霉產(chǎn)凝乳 酶的凝乳活性約為 ，活 性 較 低。 本 研 究 中 微 孢 根 霉 經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng) ，得 到凝乳酶活性 達(dá)，具 有 較高的產(chǎn)酶活性 ，遠(yuǎn) 高 于 國 內(nèi)外有關(guān)天然真菌液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的報道 ，具 有 應(yīng)用于凝乳酶生產(chǎn)的潛力。今后可對該菌株產(chǎn)凝乳酶的純化和性質(zhì)做深入研究 ，為 今后該酶的應(yīng)用奠 定基礎(chǔ)。表 部分真菌發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶情況 菌株發(fā)酵方式凝乳酶活性參考文獻(xiàn)微孢根霉 液體發(fā)酵本研究米黑根毛霉固體發(fā)酵第 期孫倩等：微孢根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件優(yōu)化 表 （續(xù)）菌株發(fā)酵方式凝乳酶活性參考文獻(xiàn)高大毛霉液體發(fā)酵毛霉液體發(fā)酵根霉 液體發(fā)酵根霉 液體發(fā)酵 結(jié)論新篩選 得到一株微孢根霉 可 高 產(chǎn) 凝 乳 酶。通過單因素優(yōu)化試驗得到其發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的最 佳條件為：酒 糟 質(zhì) 量 濃 度 ，酵母浸粉質(zhì)量濃 度，磷