流感病例采樣培訓

1、 流行性感冒病毒屬于正粘病毒科。 正粘病毒的核酸分節(jié)段。 正粘病毒科僅有一個種，即流行性感冒病毒，簡稱流感病毒。流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原體。 甲型流感病毒除了感染人外，還可引起禽、豬等多種動物感染。由于該病毒抗原性易發(fā)生變異，曾多次引起世界性大流行，例如，19181919年的大流行中，全世界至少有2000萬人死于流感。乙型流感病毒僅感染人且致病性較低。丙型流感病毒只引起人類不明顯或輕微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分離成功。 形態(tài)與結構：形態(tài)多為球形，直徑為80120nm，初次從患者體內分離出的病毒有時呈絲狀或桿狀。 流感病毒核酸

2、為分節(jié)段的單負鏈RNA，由核心和衣殼組成的核衣殼呈螺旋對稱，有包膜，表面有刺突。核心：流感病毒RNA分節(jié)段，甲型和乙型由8個節(jié)段、丙型由7個節(jié)段組成。各片段的長度在8902341bp之間。由于病毒分節(jié)段復制，病毒成熟時再重新裝配于子代病毒體中，所以病毒在復制過程中極容易發(fā)生基因重組而導致新病毒株的出現(xiàn)，這也是流感病毒易發(fā)生變異的主要原因。每個基因節(jié)段分別編碼不同的蛋白質。16片段分別編碼PB2、PB1、PA、HA、NP和NA單個蛋白，第7片段編碼M1和M2兩個蛋白，第8片段編碼NS1和NS2兩個蛋白。 核蛋白（NP）：是病毒的主要結構蛋白，構成病毒衣殼，它與3種RNA多聚酶復合體（PB1、PB

3、2、PA）一起與RNA節(jié)段相連形成核糖核蛋白（RNP），即為核衣殼，呈螺旋對稱排列。核蛋白抗原結構穩(wěn)定，很少變異，與M蛋白一起決定病毒的型特異性，但其抗體沒有中和病毒的能力。 包膜：病毒體的包膜由兩層組成，內層為基質蛋白M1，其抗原結構較穩(wěn)定，具有型特異性，但相應抗體不具有中和病毒的能力，而在增加病毒包膜的韌性與完整性方面起重要作用。包膜外層來源于宿主細胞膜的脂質雙層膜，M2為嵌于包膜中的膜蛋白，形成膜通道，利于脫殼及HA的產(chǎn)生。 刺突：流感病毒的包膜上鑲嵌有兩種刺突，即血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA），均以疏水末端插入到脂質雙層中。血凝素的數(shù)量較神經(jīng)氨酸酶多，大約為4 15 1。 血凝素（

4、HA）：呈三棱柱形，糖蛋白成分，占病毒蛋白的25%。HA為三聚體，每條單體前體（HA0）由HA1和HA2通過精氨酸及二硫鍵連接而成，當精氨酸被細胞蛋白酶裂解而形成僅由二硫鍵連接的HA1和HA2時，病毒才有感染性。 HA1是同紅細胞、宿主細胞受體（唾液酸）相結合的部位，因而與感染性有關； HA2具有膜融合活性，促使病毒包膜與胞飲細胞膜的融合并釋放核衣殼。HA抗原結構易發(fā)生改變，是劃分甲型流感病毒亞型的主要依據(jù)。標本采集和檢測標本采集和檢測1、標本采集：按照本指南的應急監(jiān)測方案（附件2）要求，采集相關標本進行檢測。具體標本采集類型、方法參見全國流感/人禽流感監(jiān)測實施方案的“流感監(jiān)測實驗技術操作規(guī)范

5、”。2、標本檢測：標本檢測方法和流程參見附件3人甲型H1N1流感病例標本采集和實驗室檢測指南（暫行）。3、生物安全要求：甲型H1N1流感病毒培養(yǎng)應在具有資質的BSL-3實驗室中進行，標本儲存、包裝和運送應按照病原微生物實驗室生物安全管理條例（國務院424號令）和可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號令）等有關規(guī)定執(zhí)行。甲型甲型H1N1感冒病毒的檢測：感冒病毒的檢測：所有甲型H1N1感冒疑似病例應該采集上呼吸道標本來檢測甲型H1N1感冒病毒。推薦采集的呼吸道標本：推薦采集的呼吸道標本：疾病發(fā)病后應盡快采集如下標本：鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔沖洗液/

6、吸取物。如果不能收集這些標本，可合并鼻拭子與口咽拭子。氣管插管的病人也應收集氣管吸取物。標本應置于無菌病毒運輸液（VTM），并立即用冰塊或冰排保存或置于4（冰箱），并馬上運送至實驗室。臨床樣品收集人員及實驗室人員的感染控制指導請見相關文件。 （1）拭子：）拭子：理想的情況下，標本應使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維），用鋁或塑料做桿。不推薦棉拭子和木桿。不能用海藻酸鈣做的拭子收集標本。標本采集管應包含2毫升病毒運輸液（例如，含有蛋白質穩(wěn)定劑，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩沖液）。（2）臨床標本儲存：）臨床標本儲存：所有呼吸道標本應保存在4，并盡快放置在-70。如果沒有-70冰箱，標本應保

7、存在4，但不應超過4天。（3）臨床標本運輸：）臨床標本運輸：臨床標本應按照A類包裝要求運送，并用干冰運輸。所有標本應標示清楚。疑似病例標本運送應包含的信息請參照禽流感標本運輸。 （3）檢測程序）檢測程序：呼吸道標本應首先應用real time RT-PCR方法檢測A型流感病毒的M基因、Swine（H1N1）的HA基因和NP基因，以及質控對照RNP基因。同時，接種MDCK細胞或SPF雞胚進行病毒分離，并測定病毒的全基因組序列。 （4）推薦的檢測方法）推薦的檢測方法：用Real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1感冒病毒。 （5）其他檢測方法）其他檢測方法 *快速流感抗原檢測快速流感抗原檢

8、測：一些商用快速檢測可以區(qū)分A和B型流感病毒。快速檢測實驗A型流感陽性的病例符合可能病例的標準。這些實驗對檢測甲型H1N1流感病毒臨床標本的敏感性和特異性未知，而且檢測季節(jié)性流感病毒的靈敏度不佳。因此，快速檢測陰性結果可能是假陰性，不能作為甲型H1N1流感感染的最后診斷。 *免疫熒光法：免疫熒光法：免疫熒光試驗可以區(qū)分A和B型流感病毒。檢測A型流感陽性的病例符合可能病例的標準。免疫熒光試驗的結果取決于臨床標本的質量，操作技能，對檢測甲型H1N1感冒病毒臨床標本的敏感性和特異性未知。因此，免疫熒光試驗陰性結果可能是假陰性，不能作為甲型H1N1流感感染的最后診斷。 * 病毒培養(yǎng)：病毒培養(yǎng)：可用MD

9、CK細胞和SPF雞胚分離甲型H1N1流感病毒可以診斷感染，但無法為臨床診斷及時提供結果。病毒分離陰性并不能排除感染甲型H1N1流感病毒1、 鼻拭子：將帶有聚丙烯纖維頭的拭子輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出。以另一拭子拭另側鼻孔。將拭子頭浸入采樣液中，尾部棄去。2、 咽拭子：用帶有聚丙烯纖維頭的拭子擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，同樣將拭子頭浸入采樣液中，尾部棄去。 注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。3、鼻咽抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液5ml涮洗收集器

10、3次。鼻拭子咽拭子鼻腔吸引液 4、 漱口液：用10 ml生理鹽水漱喉。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓生理鹽水在咽部轉動。然后，用平皿或燒杯收集洗液5、鼻洗液：患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將5 ml生理鹽水注入一側鼻孔，囑患者同時發(fā)K音以關閉咽腔。然后讓患者低頭使生理鹽水流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復此過程洗兩側鼻孔。 1、新鮮的臨床采集標本應在4條件下24小時內運送至全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室。未能24小時內送至實驗室的，應置-70或以下保存。標本送至實驗室后，病毒分離標本應盡快進行接種分離，24小時內能進行接種的可置于4保存，如未能接種應置-70或以下保存。 2、凍存的臨床采集標本應在

11、凍存的條件下，低溫送至實驗室。凍存的標本送到實驗室后，24小時內能進行病毒分離的，可以放置4保存。如未能分離的標本應置-70或以下保存。 3、臨床標本采集管建議使用帶螺口的塑料管。 甲型H1N1流感病毒培養(yǎng)應在具有資質的BSL-3實驗室中進行，標本儲存、包裝和運送應按照病原微生物實驗室生物安全管理條例（國務院424號令）和可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號令）等有關規(guī)定執(zhí)行。 1、一級防護、一級防護 （1）適用于發(fā)熱門(急)診的醫(yī)務人員。 （2）穿工作服、隔離衣，戴工作帽和醫(yī)用防護口罩。 （3）每次接觸病人后立即進行手清洗和消毒。手消毒用0

12、.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒劑(洗必泰醇、新潔爾滅醇、75%酒精等)揉搓13分鐘。 2、二級防護、二級防護（1）適用于進入隔離留觀室和專門病區(qū)的醫(yī)務人員，接觸從病人身上采集的標本、處理其分泌物、排泄物、使用過的物品和死亡病人尸體的工作人員，轉運病人的醫(yī)務人員和司機。（2）進入隔離留觀室和專門病區(qū)必須戴醫(yī)用防護口罩，每4小時更換1次或感潮濕時更換；穿工作服、隔離衣、鞋套，戴手套、工作帽。（3）每次接觸病人后立即進行手清洗和消毒。手消毒用0.30.5%碘伏消毒液或快速手消毒劑(洗必泰醇、新潔爾滅醇、75%酒精等)揉搓13分鐘。（4）對病人實施近距離操作時，戴防護眼鏡。（5）注意呼吸道及粘膜防

13、護。 3、三級防護、三級防護 （1）適用于為病人實施吸痰、氣管切開和氣管插管的醫(yī)務人員。（2）除二級防護外，還應當加戴全面型呼吸防護器。 （1）防護服：符合GB19082-2003醫(yī)用一次性防護服技術要求，可為聯(lián)體或分體式結構，穿脫方便，結合部嚴密。袖口、腳踝口應為彈性收口，具有良好的防水性、抗靜電性、過濾性效率和無皮膚刺激性。 （2）防護口罩：符合 GB19083-2003醫(yī)用防護口罩技術要求，口罩可分長方型和密合型，應當配有鼻夾，具有良好的表面抗?jié)裥?，對皮膚無刺激，氣流阻力在空氣流量為85L/min情況下，吸氣阻力不得超過35mmH2O，濾料的顆粒過濾效率應當不小于95%。也可選用符合N95或FFP2標準的防護口罩。標本編號姓 名性別年齡職業(yè)*