蛋白質(zhì)定量：

1、實(shí)驗(yàn)原理BCAbicin chon in i c a cid就是一種穩(wěn)定得水溶性復(fù)合物,在堿性條件下，二 價(jià)銅離 子可以被蛋白質(zhì)復(fù)原成一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子可以與BCA相互作用，兩分子得BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色得絡(luò)合物，該復(fù)合物為水溶性，在562 n m處顯示強(qiáng)吸光性，在一定濃度范圉內(nèi)，吸光度與蛋口質(zhì)含量呈良好得線(xiàn)性關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，因此可以根據(jù)待測(cè)蛋口在 562nm處得吸光度訃算待測(cè)蛋白濃度。Cir'STEP 1.Prolein + Cu原理圖：步實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1 o BCA定量試劑盒:含A液與B液A液:BCA堿性溶液配方:1 %BCA二鈉鹽,0。4%氫氧化鈉,0、1 6%酒石酸

2、鈉，2% 無(wú)水碳酸鈉,0、95%碳酸氫鈉,這些液體混合后再調(diào) PH至I 1。25 B液：4%硫酸銅2 ?牛蛋白血清BSA3。待測(cè)得蛋白樣品實(shí)驗(yàn)步驟1 ?配置BCA工作液:將A液與B液搖晃混勻，按照 A:B=50 : 1得比例配置BC A工 作液，充分混勻。BCA工作液室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定，故現(xiàn)用現(xiàn)配2、 配置不同濃度得標(biāo)準(zhǔn)蛋白液BSA ,1ug/ul,2. 5 ug/u 1 ,5 u g/ul,7.5 ug/ul,1 0 ug/u l，待測(cè)蛋白樣品在什么溶液中，就用該溶液來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋口液如待測(cè)樣品溶于強(qiáng)RIP A裂解液，那么用強(qiáng) RIPA裂解液來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)蛋口液。3.取空口組Oug/ul BS A

3、 各濃度得標(biāo)準(zhǔn)蛋口液5ul參加9 6孔板中，巧取待測(cè)得 蛋白樣品5ul,參加9 6孔板。0.1 ml samplMixworki50partsy + 1MixPS:上圖加樣得量?jī)H作為參考，蛋白液與BCA匚作液得比比例符合即可、 4。向各孔得蛋白液中參加 30 0 u 1得BCA工作液，混勻,37度放置30分鐘，加 樣 時(shí)應(yīng)當(dāng)動(dòng)作輕柔,防止產(chǎn)生氣泡影響讀數(shù)、 PS:溫度與放置時(shí)間可以調(diào)整，可在 6 0 度放置3 0分鐘o r室溫放置2小時(shí)。5、靜置結(jié)束后，冷卻至室溫,用酶標(biāo)儀測(cè)定562 n m岀得吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。Incubate: 30 min. at 37 CSpectr oRh(ad

4、b3t meter? %方The n cool6、根拯待測(cè)樣品得吸光度，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) ,訃算蛋tl得濃度?？记绊氈狟CA 法測(cè)定蛋口濃度時(shí)，吸光度可隨時(shí)間得延長(zhǎng)不斷加深，且顯色反響會(huì)隨溫度 升 高而加快，故如果濃度較低，適合較高溫度孵育 or 延長(zhǎng)孵育時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)蛋口液得加量應(yīng) X準(zhǔn)確，如果加量不準(zhǔn)確，會(huì)導(dǎo)致制作出來(lái)得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)出現(xiàn)偏差，影響待測(cè)樣品得濃度計(jì)算，所以一方面需要用梯度稀釋得方法來(lái)配置標(biāo)準(zhǔn)蛋口液，另一方面應(yīng)使用精確度高得移液槍、A 液與 B 液混合可能出現(xiàn)渾濁，此時(shí)應(yīng)成分振蕩混勻 , 最后可見(jiàn)透明溶液。 為加快 BCA 法測(cè)定蛋口濃度得速度可以適當(dāng)用微波爐加熱 , 但切勿過(guò)熱。 當(dāng)結(jié)果

5、出現(xiàn)空口組本身就有較高得背景，可用 Bra dford 法重新測(cè)定蛋口濃度。 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定快速簡(jiǎn)便 ,45 分鐘內(nèi)完成 準(zhǔn)確靈敏，檢測(cè)濃度為 52 0 0 mg/ml 干擾物質(zhì)少 ,BCA 法不受大局部樣品中得去垢劑等化學(xué)物質(zhì)影響 , 可兼容樣品中 高達(dá)5% 得 SDS,5%Trit on X-100,5% 得 Twee n 20 在一定濃度范圍內(nèi)，有良好得線(xiàn)性關(guān)系 檢測(cè)不同蛋口質(zhì)分子得變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)法蛋口定量 缺點(diǎn)：與熒光蛋口質(zhì)定量等方法相比，屬于化學(xué)呈色法得 BCA 法檢測(cè)靈敏度尚不夠 蔗糖、尿素、 N II 4 +與 EDTA 影響測(cè)定結(jié)果BCA 蛋白定量與 B r a d

6、f o rd 法蛋白定量得區(qū)別：1 、Bradford 法測(cè)得得主要就是堿性氨基酸與芳香族氨基酸, BCA 那么沒(méi)有選擇性亠 2、BCA 法蛋白濃度定量就是二價(jià)銅離子在堿性得條件下， 可以被蛋白質(zhì)復(fù)原成一價(jià)銅 離 子(biuret rea c tion)-價(jià)銅離子與獨(dú)特得 BCA Solution A (含有BCA)相互作用產(chǎn) 生敏 感得顏色反響、兩分子得 BCA 螯合一個(gè)銅離子，形成紫色得反響復(fù)合物。該水溶 性 得復(fù)合物在 562nm 處顯示強(qiáng)烈得吸光性，吸光度與蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好得 線(xiàn)性關(guān)系， 因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。 -Bradford 法蛋白定量就是染料與蛋 白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收得改變， 從 46 5nm 變?yōu)?595nm, 光吸收增加。蛋白質(zhì) 染 料復(fù)合物具有高得消光系數(shù)， 因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定得靈敏度, 最低檢出量為 lpg蛋白。染料與蛋白質(zhì)得結(jié)合就是很迅速得過(guò)程,大約需2m in,結(jié)合物得顏色在lh內(nèi)就是穩(wěn)定得。一些陽(yáng)離子，如K + ,Na+,Mg2 + ,(NH 4 ) 2 SO 4