PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量

1、SDS - PAGESDS - PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量相對(duì)分子量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解了解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學(xué)會(huì)用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相理，并學(xué)會(huì)用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。對(duì)分子量。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開(kāi)，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計(jì)的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量。 SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡(jiǎn)稱，它是一種陰離子去污劑，

2、它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，就可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點(diǎn)一致，便于比較。三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材1.直流穩(wěn)壓電泳儀 2.垂直平板電泳槽（含玻璃板、夾條、梳齒、夾子等）3.移液器（1.0ml、200l、20l）4.微量注射器（20l）5.燒杯、培養(yǎng)皿、試管、滴管、直尺 6.脫色搖床四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑1. 凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g

3、和亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g重蒸水溶 解后，定容至100ml，棕色試劑瓶4保存，30天內(nèi)使用。 2. 分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 18.15 Tris（三羥甲基氨基甲烷），少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH8.8，重蒸水定容至100ml，4保存。3. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris, 少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH6.8，重蒸水定容至100ml，4保存。4. 10%SDS，室溫保存。5. 兩類樣品緩沖液： 2倍還原緩沖液（2reducing buffer） 0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml 甘

4、油 2.0 ml 質(zhì)量濃度10%SDS 4.0ml 質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍(lán) 0.5ml -巰基乙醇 1.0 ml 總體積10 ml 四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑6. 電極緩沖液，pH8.3。 Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4保存。7. 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（上海產(chǎn)）。 開(kāi)封后溶于200l重蒸水，加200l 2倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20小管，-20保存。臨用前沸水浴35min，其相對(duì)分子量（Mr）如下： 兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌動(dòng)蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制劑 20 100 雞蛋

5、清溶菌酶 14 4008. 質(zhì)量濃度為10%過(guò)硫酸銨： （臨用前配制臨用前配制）9. 染色液： 0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，加入40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸餾水定容至100ml，過(guò)濾。10. 脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml重蒸水混合。11. 待測(cè)蛋白樣品。 12. 1%瓊脂糖（最好用電極液配）13. TEMED 五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟1、洗凈晾干電泳槽、玻璃板、夾條、梳齒等。、洗凈晾干電泳槽、玻璃板、夾條、梳齒等。安裝后用安裝后用1%瓊脂糖封瓊脂糖封玻璃板兩側(cè)及底部。玻璃板兩側(cè)及底部。2、分離膠的選擇和配置方法、分離膠的選擇和配置方法 1）按照待分離蛋白質(zhì)的大致分子

6、量選用不同濃度的膠。）按照待分離蛋白質(zhì)的大致分子量選用不同濃度的膠。 2）分離膠和濃縮膠的配制方法）分離膠和濃縮膠的配制方法五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟3、分離膠的灌制、分離膠的灌制 按照上表左邊操作。因加入按照上表左邊操作。因加入TEMED后凝膠就開(kāi)始聚合，故應(yīng)立即混勻混合液，然后用滴管后凝膠就開(kāi)始聚合，故應(yīng)立即混勻混合液，然后用滴管吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，避免氣泡。留出梳齒的齒高加吸取分離膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，避免氣泡。留出梳齒的齒高加1cm空間以便灌注濃縮膠。空間以便灌注濃縮膠。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重

7、蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約4060min，待分離膠聚合，待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水。完全后，除去覆蓋的重蒸水。4、濃縮膠的灌制、濃縮膠的灌制 （等分離膠聚合后配制）（等分離膠聚合后配制） 按照上表右邊操作。混勻后灌注在分離膠上。小心插入梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直按照上表右邊操作?；靹蚝蠊嘧⒃诜蛛x膠上。小心插入梳齒，避免混入氣泡，將電泳槽垂直靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合（約靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合（約40min）。）。5、樣品的制備、樣品的制備 1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的制備）標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的制備 （樣品約（樣品約5-10g，最好離心取上清加樣），最好離心取上清加樣） 取分裝好的

8、取分裝好的20 l低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱35min，取出冷卻。，取出冷卻。 2）待測(cè)樣品的制備）待測(cè)樣品的制備 （同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品處理）（同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品處理）6、 電泳電泳 1）待濃縮膠完全聚合后，標(biāo)記好加樣孔位置，將電泳槽注滿電極緩沖液，小心拔出梳齒，）待濃縮膠完全聚合后，標(biāo)記好加樣孔位置，將電泳槽注滿電極緩沖液，小心拔出梳齒，用電極緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。用電極緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。 2）用微量注射器按次序向加樣孔內(nèi)加樣。）用微量注射器按次序向加樣孔內(nèi)加樣。 3）接上電泳儀，上電極接電源負(fù)極，下極接正極。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電流至）接

9、上電泳儀，上電極接電源負(fù)極，下極接正極。打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電流至2030mA并保并保持電流強(qiáng)度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約持電流強(qiáng)度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約1cm時(shí)，停止電泳。時(shí)，停止電泳。 五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟7、 染色與脫色染色與脫色 小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中。加染色液染色小心將膠取出，置于一大培養(yǎng)皿中。加染色液染色30min，傾出染色液，加入脫，傾出染色液，加入脫色液，數(shù)小時(shí)更換一次脫色液，直至背景清晰。色液，數(shù)小時(shí)更換一次脫色液，直至背景清晰。8、相對(duì)分子量的計(jì)算、相對(duì)分子量的計(jì)算 用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的距離，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率（的距離，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率（R）：）： 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率 = 樣品遷移距離（樣品遷移距離（cm）/ 指示劑遷移距離（指示劑遷移距離（cm） 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以標(biāo)準(zhǔn)