最新植物生理指標(biāo)測定方法

1、實(shí)驗(yàn)一 植物葉綠素含量的測定（分光光度法）(張憲政，1992)一、原理     根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即ACL式中：比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性

2、。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用效率的大小，比值高則大，則反之。二、材料、儀器設(shè)備及試劑    試劑：1）95%乙醇（或80%丙酮） 三、實(shí)驗(yàn)步驟      稱取剪碎

3、的新鮮樣品 0.20.3g，加乙醇10ml，提取直至無綠色為止。把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，在波長663nm和645nm下測定吸光度。       四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果按計(jì)算丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的計(jì)算】葉綠素a的含量（mg/g） =（12.71´OD663  2.59´OD645）V/1000*W葉綠素b的含量（mg/g） =(22.88OD645  4.67OD663) V/1000*W 葉綠素a、b的總含量（mg/g） =(8.04

4、0;OD663 +20.29´OD645) V/1000*W按Inskeep公式葉綠素a的含量（mg/g） =（12.63´OD663  2.52´OD645）V/1000*W葉綠素b的含量（mg/g） =(20.47OD645  4.73OD663) V/1000*W葉綠素a、b的總含量（mg/g） =(7.90´OD663 + 17.95´OD645) V/1000*W注：1、葉綠素a和葉綠素b的比值反映植物對光能利用率 【1】 比如陽生植物葉綠素a和葉綠素b的比值較大 【2】陰生植物葉綠素a和葉綠素

5、b的比值較小 2、丙酮-熔點(diǎn):-94 ；沸點(diǎn):56.48；是一種無色透明液體，有特殊的辛辣氣味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有機(jī)溶劑.下一步實(shí)驗(yàn)方法比較【1】95%乙醇直接提?。ǎ?】95%乙醇加熱提?。T瑞云，1985）【3】無水酒精和80%丙酮等體積混合提取實(shí)驗(yàn)二、不良環(huán)境對植物細(xì)胞膜的傷害（(張憲政，1992)）一、 原理植物組織在受到各種不利的環(huán)境條件（如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染）危害時，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能首先受到傷害，細(xì)胞膜透性增大。若將受傷害的組織浸入無離子水中，其外滲液中電解質(zhì)的含量比正常組織外滲液中含量增加，組織受傷害越嚴(yán)重，電解質(zhì)含量增加越多。用電導(dǎo)儀測定

6、外滲液電導(dǎo)率的變化，可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。在電解質(zhì)外滲透的同時，細(xì)胞內(nèi)可溶性有機(jī)物也隨之滲出，引起外滲液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸對紫外光有吸收，對紫外分光光度計(jì)測定受傷害組織外滲液消光值，同樣可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。用電導(dǎo)儀法和紫外法測定結(jié)果有很好的一致性。二、方法步驟1、取樣及處理 采用電導(dǎo)法(張憲政，1992)：將選取的幼嫩葉片和成熟葉片剪下，包在密封袋內(nèi)置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將新鮮的葉樣先用自來水輕輕沖洗葉片，除去表面沾污物，再用去離子水沖洗12次，用濾紙輕輕吸干葉片表面水分，稱0.20.3 g并剪成切段，放入50 mL帶塞試管中，加入20 mL 去離子H

7、2O，浸沒樣品45 h，各處理浸泡時間和測定溫度一致，在室溫下進(jìn)行，用DDs11型電導(dǎo)儀測其電導(dǎo)率，然后沸水浴15 min，冷卻至室溫再測一次總電導(dǎo)率值。以相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞質(zhì)膜透性大小。2、計(jì)算：植物組織浸泡的電導(dǎo)率，特稱外滲電導(dǎo)率，此測定方法稱外滲電導(dǎo)率法。（1）外滲電導(dǎo)率 K（us/cm*g) =SQ=測定電導(dǎo)率/稱取質(zhì)量 或 K（us/cm*g*ml）=SQ=測定電導(dǎo)率/稱取質(zhì)量*量取體積（2）相對電解質(zhì)滲出率. 電解質(zhì)滲出率（%）= L1（浸泡液電導(dǎo)率）/ L2（煮沸后電導(dǎo)率）×100電解質(zhì)滲出率(%)= L1(浸泡液電導(dǎo)率)-本底電導(dǎo)率/ L2（煮沸后電導(dǎo)率）-本底電導(dǎo)率

8、×100 式中：L1：組織殺死前外滲液的電導(dǎo)值；L2組織殺死后外滲液的電導(dǎo)值。注：1、事先測定水的電導(dǎo)率 2、用吸水紙吸干探頭的水分實(shí)驗(yàn)三 植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定一、目的在逆境條件下（旱、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加，植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種積累的脯氨酸多。因此測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。二、原理磺基水楊酸對脯氨酸有特定反

9、應(yīng)，當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸溶液中。然后用酸性茚三酮加熱處理后，茚三酮與脯氨酸反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色化合物，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下測定吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。三、材料、儀器及試劑1.試劑及配制：（1）2.5酸性茚三酮溶液配制：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L1磷酸中（原液稀釋2.3倍），攪拌加熱（70）溶解，貯于4冰箱中，2-3日有效。（2）3磺基水楊酸配配制：3.496g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。（3）10g·ml-

10、1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制：精確稱取20mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度（為100g·ml1脯氨酸母液），再吸取該溶液10ml， 加蒸餾水稀釋定容至100ml，即為10g·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1.1取6支試管，編號，按下表配制每管含量為012g的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。加入表中試劑后，置于沸水浴中加熱30min。取出冷卻。以去離子水溶液為空白對照，在520mm波長處測定吸光度（A）值。試 劑管 號01234510g·ml-1脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）蒸餾水（ml）冰醋酸（ml）3%磺基水楊酸2

11、.5酸性茚三酮（ml）022240.21.82240.41.62240.61.42240.81.22241.01.0224每管脯氨酸含量（g）02468101.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以15號管脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的測定2.1脯氨酸的提取稱取0.20.3g葉片于20ml試管 + 10ml 3磺基水楊酸溶液沸水浴10min（提取過程中要經(jīng)常搖動）冷卻過濾于干凈的試管中脯氨酸提取液。2.2測定吸取酶提取液2ml + 2ml H2O + 2ml冰醋酸 + 4ml 2.5酸性茚三酮沸水浴30min溶液呈紅色冷卻取上層液于比色杯520mm處測定吸光度（A）值。五、計(jì)算結(jié)果

12、從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品測定液中脯氨酸的含量，按下公式計(jì)算樣品中脯氨酸含量：X×提取液總量（ml）脯氨酸含量（g·g1Fw） 樣品鮮重（g）× 測定時提取液用量（ml）公式中：X 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的脯氨酸含量（g）實(shí)驗(yàn)四 植物體內(nèi)丙二醛含量的測定一、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關(guān)系。測定植物體內(nèi)丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色的三甲川（3、5、5三甲基惡唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波長在532n

13、m。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物含量時一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應(yīng)物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g·g1Dw，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入F

14、e3的終濃度為0.5nmol· L1。在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值，即可計(jì)算出丙二醛含量。二、實(shí)驗(yàn)步驟（1）提取采用硫代巴比妥酸顯色法（趙世杰等，2002）。稱取0.20.3 g樣品，加10%三氯乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml 三氯乙酸進(jìn)一步研磨，勻漿后4000 rpm，離心10min。（2）顯色取上清液5 mL，加0.6% TBA 5 mL，混合后在100水浴上煮沸30 min，迅速在冰浴上冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，方法一： MDA質(zhì)量摩爾濃度(nmol/g)=( A532-A6

15、00)×VZ×V1/(0.155×W×V2)式中：VZ: 反應(yīng)液總量(4 mL)； V1: 提取液體積(10 mL)； V2: 測定用用提取液量(2 mL)； W: 取樣葉鮮重(g)0.155:為MDA的消光系數(shù)（nmol/l）方法二：方程組： A450=（85.4×103）·C糖（A532A600）=（155×103）·CMDA+（7.4×103）·C糖解得： A450 C糖= = 11.71A450（mmol·L1） 85.4×103 CMDA= 6.45（A532A60

16、0）0.56A450（mol·L1）公式中：A450在450nm波長下測得的吸光度值A(chǔ)532在532nm波長下測得的吸光度值A(chǔ)600在600nm波長下測得的吸光度值 1.55×105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、CMDA分別是反應(yīng)混合液中可溶性糖、MDA的濃度。1.  按下式計(jì)算提取液中MDA濃度反應(yīng)液體積（ml） CMDA × 1000 提取液中MDA濃度（mol·ml1）= 測定時提取液用量（ml）2.按下式計(jì)算樣品中MDA含量 提取液中MDA濃度（mol·ml1）×提取液總量（ml） MDA含量（mol·g

17、1 Fw）= 植物組織鮮重（g）試劑： 1、10三氯乙酸：稱取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml2、0.6硫代巴比妥酸（用10三氯乙酸配制）：稱0.6707g TBA用少量1mol/L氫氧化鈉溶解后加10TCA溶解定容至100ml（4貯存） 實(shí)驗(yàn)五、SOD活力測定(NBT還原法)植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過程的變化。近來大量研究表明，植物在逆境脅迫或衰老過程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。過剩自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細(xì)胞膜

18、系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時會導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。自由基是具有未配對價(jià)電子的原子或原子團(tuán)。生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基主要有超氧自由基（O2）、羥自由基（OH.）、過氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物細(xì)胞膜有酶促和非酶促兩類過氧化物防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶。抗壞血酸（VC）、VE和還原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。SOD、CAT等活性氧清除劑的含量水平和O2、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作為植物衰老的生理生化指標(biāo)。超氧自由基（O2.）是生物細(xì)

19、胞某些生理生化反應(yīng)常見的中間產(chǎn)物。自由基是本身帶有不成對價(jià)電子的分子、原子、原子團(tuán)或離子，化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，是活性氧的一種。如果細(xì)胞中缺乏清除自由基的酶時，機(jī)體就會受到各種損傷。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），簡稱SOD，能通過歧化反應(yīng)清除生物細(xì)胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2。H2O2由過氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2，從而減少自由基對有機(jī)體的毒害。一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于動、植物體內(nèi)，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)超氧物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活

20、性大小。在有氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生O2-，可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2-，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計(jì)算出酶活性大小。二、試劑（一）試劑（1）0.2 mol/L pH7.8磷酸鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液：A液（0.2 mol/L NaH2PO4溶液）：準(zhǔn)確稱取NaH2PO4·2H2O （MW=156.01）15.715g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后 ，移入500mL容量瓶中用蒸餾水定容至

21、刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。B液（0.2 mol/L Na2HPO4溶液）：準(zhǔn)確稱取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）71.63g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液34mL與B液366mL充分混勻后即為0.2mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液。4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液取0.2 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液250mL，移入1000 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）130mmol/L 蛋氨酸（

22、Met）磷酸鈉緩沖液準(zhǔn)確稱取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.9699g于小燒杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）?！救苡谒?.3g/100ml 25，不溶于有機(jī)溶劑】4保存可用12d.（4）750mol/L 氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.03066g NBT用磷酸緩沖液定容至50ml，避光4保存，先用現(xiàn)配.（5）100mol/L EDTANa2溶液：稱取0.03721g EDTANa2用水定容至1000ml【稱取7.442 g EDTANa2用水

23、定容至200ml，吸取1ml用水定容1000ml】（6）20mol/L 核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存【稱取1.8825g核黃素用少量NaOH溶解并用蒸餾水定容至25ml，吸取1ml用水定容1000ml】。4保存810天。三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 酶液提取取植物葉片0.2g0.3g于預(yù)冷的研缽中，加2ml預(yù)冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為10ml。于4000rpm下離心15min，上清液即為SOD粗提液。2. 顯色反應(yīng)取試管3支，1支為測定管，另2支為對照管，按下列加入一依次加入各溶液：名稱樣品管對照管1對照管

24、250mmol/L 磷酸緩沖液（ml）5.05.05.0130mmol/L Met溶液（ml）0.30.30.3750mol/L NBT溶液（ml）0.30.30.3100mol/L EDTANa2液（ml）1.01.01.0去離子水（ml）2.02.02.020mol/L 核黃素（ml）0.30.30.30.3（酶液）0.3（緩沖液）0.3（緩沖液）混勻后將1支對照管置暗處，其它各管于4000Lx日光下反應(yīng)20min，然后立即遮光，以遮光管為對照調(diào)零，于560nm下測定光密度。（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，低時延長）。3.SOD活性測定與計(jì)算至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管做空白，分

25、別測定其它各管的吸光度。四、結(jié)果計(jì)算 已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50為一個酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性(AckAE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)=(AckAE)/(Ack×0.015×W)SOD比活力SOD總活性/蛋白質(zhì)含量上式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示； SOD比活力：單位以酶單位mg蛋白表示Ack：照光對照管的吸光度 AE：樣品管的吸光度V：樣品液總體積（ml） Vt測定時樣品用量（ml）實(shí)驗(yàn)六、過氧化物酶活性測定一、試驗(yàn)?zāi)康模哼^氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，他與

26、呼吸作用、光合作用以及生長素的氧化等都有密切關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中他的活性不斷發(fā)生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。通過本實(shí)驗(yàn)了解過氧化物酶的作用，掌握常用的測定過氧化物酶的方法愈創(chuàng)木酚法。二、實(shí)驗(yàn)原理：在過氧化物酶催化下，雙氧水將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在470 nm處有最大吸收峰，故可以通過測其吸光度的變化測定過氧化物酶的活性。三、實(shí)驗(yàn)試劑 1、0.05 mol/L PH 7.0的磷酸緩沖液： 0.2M A液（Na2HPO4）61ml和0.2M B液（NaH2PO4）39ml混合100ml，用去離子水定容400ml2、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液：取

27、0.6207g定容100ml 1%愈創(chuàng)木酚溶液：吸取1毫升愈創(chuàng)木酚，加入少量95%酒精溶解，用水定容100ml，放于棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆?3、2%雙氧水溶液:：取30% H2O2 10ml用去離子水定容150ml4.、反應(yīng)混合液取50mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）30mL，2%過氧化氫10mL，1%愈創(chuàng)木酚10mL混合。四、操作步驟1酶液提?。呵逑锤蓛羧~片擦干，稱取0.20.3 g葉片，剪成小片，放入研缽加入適量10%PVPP（除去酚類物質(zhì)）、石英沙、及2ml 50mmol的PH 7.0(5.5-7.5)的磷酸緩沖液PBS（0.02-0.1mmol）進(jìn)行研磨，磨碎后在加入8mlPBS溶液

28、洗滌研缽一并裝入離心管內(nèi)，4下4000rmin-1離心15min，收集上清液4保存?zhèn)溆谩?顯色反應(yīng)類別對照管樣品管反應(yīng)液3.0 mL溫度25緩沖液0.5 mL酶液0.5 mL測定波長470nm五、計(jì)算 過氧化物酶活性（OD470/(min.g)） =（A470×VT）/（W×VS×0.01×t） 式中：A470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，W為葉片鮮重g，t為反應(yīng)時間min，Vt為提取酶液總體積ml，Vs為測定時取用的酶液體積ml。實(shí)驗(yàn)19植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 考馬斯亮藍(lán) G 250 染色法一、原理 考馬斯亮藍(lán) G 250 （ Coomassie

29、 brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白質(zhì) 染料結(jié)合的原理，定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍(lán) G-250 存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由 465 nm 變成 595 nm ，通過測定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約 2 min 即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定 1 h ，之后，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此法靈敏度高（比

30、Lowry 法靈敏 4 倍），易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點(diǎn)是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。 二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）試劑 1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（100 g/mL 牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液40 mL ，用蒸餾水稀釋至100 mL 即可。 2. 考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取 100 mg 考馬斯亮藍(lán) G-250 ，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入 100 mL 85（ W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到 1000 mL ，貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個月。 三、實(shí)驗(yàn)

31、步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取 6 支試管，按表 261 加入試劑，搖勻，向各管中加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，并放置 5 min 左右，以 0 號試管為空白對照，在 595 nm 下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 試 劑管 號012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（ mL ）00.200.400.600.801.00蒸餾水量（ mL ）1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量（ g ）0204060801002. 樣品測定 （ 1 ） 樣品提取 稱取鮮樣 0.25 0.5 g ，用 5 mL 蒸餾水或緩沖液研磨成勻漿后， 3000 r/min 離心

32、10 min ，上清液備用。 （ 2 ）吸取樣品提取液 0.3 mL （視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個樣品重復(fù) 2 次），加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。 四、結(jié)果計(jì)算 （ mg/g ）   式中： C 查標(biāo)準(zhǔn)曲線值， g 。 V T 提取液總體積 , mL 。 W F 樣品鮮重 , g 。 V S 測定時加樣量 , mL 。  注意點(diǎn)：1，考馬斯亮藍(lán)G-250所配溶液不穩(wěn)定，所以每次實(shí)驗(yàn)都必須新配，且必須新做標(biāo)準(zhǔn)曲線；2，考馬斯亮藍(lán)G-250配制完畢，如果發(fā)現(xiàn)溶液中有絮

33、狀沉淀，可以試用濾紙過濾后使用，如果實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用過濾后的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液在與樣品接觸后短時間內(nèi)便又發(fā)生絮凝，基本上推測該考馬斯亮藍(lán)G-250過期（比較容易出現(xiàn)）。實(shí)驗(yàn)七、過氧化氫酶的活性測定高錳酸鉀滴定法 【原理】過氧化氫酶（CAT）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。  據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2

34、+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量?！驹噭俊?】3M H2SO4：吸取濃硫酸80ml用去離子水定容至500ml【2】0.2mol/L磷酸緩沖液pH7.0；【3】0.1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）16 g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液4.87ml，稀釋至500ml，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；【實(shí)驗(yàn)步驟】 1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液

35、少量研磨成勻漿，在加緩沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。2.滴定反應(yīng)管 號對照管樣品管粗酶液(ml)0.20.23mol/L H2SO4 (ml)50PH 7.0磷酸緩沖液1.81.80.1mol/L H2O2 (ml)55條 件加入H2O2立即計(jì)時于35恒溫水浴中保溫3min3mol/L H2SO4 (ml)05用0.1mol/L KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn)所用KMnO4體積（ml）AB【結(jié)果計(jì)算】： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/g

36、FW·min)=式中 A對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT酶液總量（ml）； V1反應(yīng)所用酶液量（ml）; W樣品鮮重（g）； 1.71ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2。過氧化氫酶的活性測定紫外吸收法一、原理H2O2在240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1、酶液提取 取葉片0.20.3g加入2ml pH7.0的磷酸緩沖液少量研磨成勻漿，在加緩沖液定容轉(zhuǎn)移至10ml后轉(zhuǎn)入離心管中，4000rpm離心1

37、5min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。4下保存?zhèn)溆谩?.測定：取10ml試管3支，其中1號為樣品測定管，1號為空白管，按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管 號樣品管對照管粗酶液(ml)0.2（煮死酶液）0.2pH7.0磷酸(ml)1.51.5蒸餾水(ml)1.01.0 25預(yù)熱后，逐管加入0.5ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計(jì)算酶活性。3.結(jié)果計(jì)算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0 AS0加入煮死酶液的對照管吸光值； AS1， AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測定用粗酶液體積（ml）； FW樣品鮮重（g）； 0.1A240每下降0.1為1個酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）。高錳酸鉀滴定液的配制和標(biāo)定1高錳酸鉀滴定液（0.1molL）的