蛋白質(zhì)印跡法westernblot應(yīng)用介紹.

1、蛋白質(zhì)印跡法（western blot技術(shù)）威斯騰生物技術(shù)中心2014. 9. 1全國(guó)免電話:400-675-675WWW.Western Biotechnology Inc-Western Blot介紹Western Blot一般流程Western Blot常見問題分析Western Biotechnology Inc全國(guó)免更電話400-675-6758Western Blot 介紹Western Biotechnology Inc.全國(guó)免更電話 400-675-6758 網(wǎng)址:蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是戻國(guó)隨坦扌葩丸學(xué)的喬治斯塔 克(George Stark ) 在尼爾伯奈特(Neal

2、Burnette)于 1981 年所 著的刁“亡也生今(Analytical Biochemistry )中首次被稱為 Western Blot.蛋白免疫印跡(Western Blot)是將電泳分離后的細(xì)胞或紐織 總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特 異性抗休檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用 于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等 多個(gè)方面。Western Biotechnology Inc.全國(guó)免毋電話 400-675-6758 網(wǎng)址:電泳昨瑤ft閉和;洗»入二統(tǒng)T匕隼蛋分多次將細(xì) 胞收至一個(gè)（Protein sample

3、preparation）（1）貼壁細(xì)胞蛋白樣品收集° ° °A收集培養(yǎng)瓶或六孔板中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中。 加入PBS沖洗2-3遍，再將PBS轉(zhuǎn)移至離心管中，離心 收集細(xì)胞。C將細(xì)胞培養(yǎng)瓶或六孔板置于冰上，然后將離心好的離 心管中的液體小心傾盡并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂 解液200 口 1于離心管中并移至對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中，搖晃培養(yǎng)瓶 使裂解液與貼壁的細(xì)胞充分接觸，冰上裂解30minoD裂解結(jié)束后用細(xì)胞刮將貼壁的細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至15ml EP管中，再用超聲破%舉儀破碎細(xì)胞后，4°C下12000rpm離 心15min,吸取上層液體于新的離心管中，

4、棄掉沉淀。Western Biotechnology Inc.全匡免西電話 400-675-6758 R目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量：Bradford法（考 馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（福林-酚試劑法）、BCA法等。1、配制BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：0、25、50、100、150、200、300 gg/mL （用 PBS配制）°樣品液：取原液2 口 L至200 pL （用PBS配制）。2、操作：先取一塊新的96孔板，于下測(cè)光密度值，取溶液/樣品40pL和E液40 pL,每個(gè)濃度點(diǎn)均作三復(fù)孔，振 蕩混勻。37° C反應(yīng)10 min后，加入福林酚試劑（1: 15稀釋） 160 pL,

5、振蕩混勻，37° C反應(yīng)30 mino 630 nm下測(cè)光密度值 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度對(duì)光密度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品 蛋白濃度。Western Biotechnology Inc.全國(guó)免更電話 400-675-6758 網(wǎng)址:全國(guó)免芟電話400 675 6758Western Biotechnology IncWestern Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-675jwww.cqwesiern.u分嵩欣濃Jl與妥匂分禽范Bl栽膠濃度(%)最住分需范謝CKD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下層膠（分離膠）5ml

6、10 mliSmi20wi*L?US.06.62.9ao00.0ISM Trb(pHS 8|13IS111.010HSOS060.1e.i$210HAM03aie.H0.2flM»D0.0020 004o.ooto.oos赫置lh后制上層膠（濃縮膠）2.配制上層膠（濃縮膠）,5“SmiI10 ml4.1m fMxarflui*O.t)1.0l.OM TrbfpHI040.7S10訃03O.g08OMO.M0<040.11(M£D0.00(O.OOBaoi加完后插上梳子,靜置1 hWestern Biotechnology Inc.全匡免茨電話 400 675-6758

7、 Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-675jwww.cqwesiern.uWestern Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-675jwww.cqwesiern.uWestern Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-675jwww.cqwesiern.u'制膠過程注意事項(xiàng)：廠二操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。»加完分離膠后膠，加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被 沖變型。»灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢 速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不 會(huì)有氣泡

8、。A分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸 干。»插梳子時(shí)要使梳子保持水平。Western Biotechnology Inc.全國(guó)免賀電話八006756758 網(wǎng)址www.cqweslern.沖占.' 鬲，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可.跑上層膠，70V 35Ma/塊 45 min;跑下層膠，100V 35Ma/塊膠1 h左右.將筱膠和因相基質(zhì)象三明治一樣央在用緩沖液濕潤(rùn)濾紙間 -I紙I膠I膜I紙I 槽式濕轉(zhuǎn)法將換膠和固相基質(zhì)央在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中. -I海綿I紙I膠I膜I紙I海綿I +Western Biotechnology I

9、nc.400 675-6758 局址 Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758轉(zhuǎn)膜H推薦：100V , 1一2,卜時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的 不同而不同。轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)> 濾紙、膠、膜之間不能有氣泡.> 濾紙、膠、膜的大小和擺放順序.> 膠和膜上要做好標(biāo)記，識(shí)別正反面和上下> PVDF膜需要100%甲醇預(yù)處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤(rùn)。Western Biotechnology Inc全國(guó)免費(fèi)電話400-675-67589轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）/麗春紅染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝 酸纖維素濾膜，換水幾次。&

10、quot;印度墨汁染色只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋 白探針Western印跡過程。將轉(zhuǎn)印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域結(jié)合上蛋白質(zhì)，目的是便抗體與特異的 蛋白質(zhì)結(jié)合.>封閉液 5 % TBST脫脂奶粉溶液（30ml ） 牛血清白蛋白溶液（BSA ）> 搖床上緩慢搖動(dòng)封閉，室溫2 h或49過夜.< Tween-20作用： 0441+性艮謝，不為抗 體與紈斥的結(jié)含°Western Biotechnology Inc.r （Primary antibody incubation）把nc膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一 抗，室溫或49在側(cè)擺

11、搖床上緩,匱搖動(dòng)孵育一小時(shí).如果一抗 孵育一小時(shí)效果不佳，可以41緩恆搖動(dòng)孵育過夜.或更據(jù)抗 體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間.回收一抗.加入TBST液，在側(cè)擺搖床上緩幔搖動(dòng)洗滌5-10分鐘.吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次.如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌 次數(shù)。注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照，通?？梢赃x用 Tubu 1 in抗體或Act in抗體,進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè).Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758(Secondary antibody inucubation)NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)

12、皿中，加入稀釋好的 熒光二抗，37 C緩幔搖動(dòng)孵育一小時(shí).二抗需根據(jù)一 抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG,則二抗需選 擇抗小鼠IgG的二抗.Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675DAB顯色法化學(xué)發(fā)光顯色法（ECL ）化學(xué)發(fā)光法（BCL）ECL顯色原理：（二抗用HRP標(biāo) 記）反應(yīng)物為過氧化物+魯米諾， 如果遇到HRP即發(fā)光，可使膠片曝光顯形.回收二抗.加入TBST液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗 滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分 鐘。共洗滌3次.如果結(jié)呆背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí) 間并增加洗滌次數(shù). ECL化學(xué)發(fā)光顯色比較常用，結(jié)

13、采容易控制，但是被催化是靈敏度差一點(diǎn) DAB顯色比較靈敏，是HRP最敏感的底物Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Blot常見問題分析Western Biotechnology Inc.全匡免費(fèi)電話400-675 6影響抗原抗體反應(yīng)的因素電解質(zhì)-一電解質(zhì)可促進(jìn)抗原抗體復(fù)合物的形成，因 此常選用各種緩沖液做為抗體的稀釋液。酸堿度抗原抗體反應(yīng)需要適宜的pH值環(huán)境，一般 為pH6. 0-8. 0.溫 度-一溫度升高可使反應(yīng)加速，但溫度高于569 時(shí)，可導(dǎo)致抗原抗體的解離，甚至變性。Western Biotechnology Inc.

14、全國(guó)免箜電話400-675-6758Western Biotechnology Inc.全國(guó)免箜電話400-675-6758Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758 RWestern Biotechnology Inc.全國(guó)免箜電話400-675-6758膠不平？凝膠漏液?膠板洗刷千凈 加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混 合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z 聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊Western Biotechnology Inc.全國(guó)免箜電話400-675-6758Western Biotechn

15、ology Inc.> 抗體浪度過.需> 封閉不丸分> 朕沒有均勻澡迄> 朕丸者圾沖液污黑> 統(tǒng)體與封閉射出現(xiàn) 夾又反應(yīng)雜夾甫檢測(cè)一執(zhí)二執(zhí)的工作滾度延長(zhǎng)対現(xiàn)對(duì)間或更換封用棉朕奇用甲醇將膜丸全沒套取膜與浹水煩對(duì)要栽手 廉，更換祈埒此膜圾沖潅檢測(cè)一執(zhí).二抗與耐囲#1Western Biotechnology Inc.Western Biotechnology Inc.是否力吏又反應(yīng)Western Biotechnology Inc.全匡免芟電話 400-675-6758 冋址:Western Biotechnology Inc.Western Biotechnolog

16、y Inc.非特異條帑多Western Biotechnology Inc.> 抗體濃度過嵩>鎂沒有均勻澡遅> 膜或舟圾沖波活柴> 封閉不克分>抗體與封用*1出現(xiàn)/ 雜交前檢測(cè)一抗.二抗 的工作滾夂丁林膜前用100%甲瑋將膜 克全澡迄V 拿取鎂與戒水紈對(duì)要裁 手去，更換新鮮轉(zhuǎn)朕皺 沖液" 檢測(cè)一抗.二抗與封囲 制是否有交反應(yīng)Western Biotechnology Inc.妥勺帶型條狀Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6

17、758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758>上樣過査» 樣嬴沉|建>> 樣嬴中的污染> 制膚不佳V陣低上樣*丁加大樣品中的SD5濃夂丁 直心樣° 確毎灌膚均勻Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Biotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Weste

18、rn Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758丁完全變性蛋白/ 確保加入足夠的DTT或卩-疏基乙醇/觀察指示劑染料，掌握恰當(dāng)?shù)碾娪緯r(shí)間Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758Western Brotechnology Inc.全國(guó)免費(fèi)電話400-675-6758型條帶或微笑”條帶Western BiotechnologY Inc全國(guó)免更電話 "006756758網(wǎng)址www.cqweslern.co01Western BiotechnologY Inc全國(guó)免更電話 "006756758網(wǎng)址www.cqweslern.co01上樣體積過大導(dǎo)致不完 全堆積 電泳過程中電場(chǎng)不均勻分離膠表面不齊/使用恰當(dāng)上樣體積/如果蛋白濃度已知，上樣時(shí)確保對(duì)稱/制膠時(shí)使分離膠表面 水平West