中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的分子生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

1、中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的分子生物學(xué)機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展 【摘要】 總結(jié)了近年來(lái)中藥逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)概況，從逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的經(jīng)典、非經(jīng)典及多靶點(diǎn)作用的角度闡述了中藥的逆轉(zhuǎn)作用，認(rèn)為其主要是通過(guò)下調(diào)P-gp蛋白及調(diào)控MRP、LRP、拓?fù)洚悩?gòu)酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、核轉(zhuǎn)錄因子、Ca2+濃度、凋亡相關(guān)基因等介導(dǎo)的【摘要】 總結(jié)了近年來(lái)中藥逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)概況，從逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的經(jīng)典、非經(jīng)典及多靶點(diǎn)作用的角度闡述了中藥的逆轉(zhuǎn)作用，認(rèn)為其主要是通過(guò)下調(diào)P-gp蛋白及調(diào)控MRP、LRP、拓?fù)洚悩?gòu)酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、核轉(zhuǎn)錄因子、Ca2+濃度、凋亡相關(guān)基因等介導(dǎo)的多藥耐藥而實(shí)現(xiàn)，其作用

2、多不局限于單一機(jī)制，而與其多靶點(diǎn)作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 中藥； 多藥耐藥； 分子生物學(xué)目前，化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，而在化療過(guò)程中易產(chǎn)生腫瘤的多藥耐藥，大大降低了其療效。因此，如何解決多藥耐藥就成為了提高化療療效，改善患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵問(wèn)題。多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，涉及多種耐藥相關(guān)蛋白1。不同腫瘤具有不同的耐藥表型，可以是某種耐藥基因表達(dá)，也可能是多種耐藥基因同時(shí)表達(dá)的結(jié)果，而由于中藥的多靶點(diǎn)作用，其可通過(guò)作用于多個(gè)耐藥相關(guān)蛋白達(dá)到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。目前，中藥抗多藥耐藥的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年來(lái)中藥在逆轉(zhuǎn)多

3、藥耐藥的分子水平的研究進(jìn)展。1 腫瘤多藥耐藥經(jīng)典途徑 P-gp蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥是研究最多，機(jī)制最為明確的多藥耐藥產(chǎn)生途徑，因此被稱為多藥耐藥的經(jīng)典途徑。由MDR1基因編碼的P-gp蛋白ATP依賴性的藥物泵，其是通過(guò)水解ATP提供的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞，使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷下降，最終使藥物細(xì)胞毒作用減弱甚至喪失出現(xiàn)耐藥2。中藥下調(diào)P-gp蛋白的實(shí)驗(yàn)研究較多，下面就分體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分別闡述。1.1 體外實(shí)驗(yàn)研究解霞等3對(duì)川芎嗪(TMP)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制的研究顯示MCF-7/ADM 細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)率為(90.600.41)，而加入非細(xì)胞毒性劑量川芎嗪后，耐藥細(xì)胞P-gp的表達(dá)率

4、則降為(69.101.65)（P0.01），結(jié)果提示TMP能顯著抑制MCF-7/ADM細(xì)胞 P-gp的表達(dá)。謝長(zhǎng)生等4復(fù)方三根制劑對(duì)MDR細(xì)胞株K562/ADR和K562/VCR逆轉(zhuǎn)作用的研究，結(jié)果復(fù)方三根制劑對(duì)K562/ADR 作用24，48，72 h后 P-gp蛋白表達(dá)量分別降為6226.56，7304.51，3101.09，而對(duì)K562/VCR作用24，48，72h后P-gp表達(dá)量分別降為105483.16，7757.02，33936.56，與空白對(duì)照組相比，能顯著下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)，且有顯著性差異（P0.05），提示其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用可能與其下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)有關(guān)。許文林等5

5、對(duì)漢防己甲素逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn) P-gp蛋白在K562/ADM細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，經(jīng)10mol/L的漢防己甲素處理細(xì)胞48h后，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度減弱，P-gp蛋白的表達(dá)減少，另外經(jīng)漢防己甲素作用后，K562/ADM細(xì)胞中的MDR1基因拷貝數(shù)明顯下降(P0.01)。1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究李貴海等6粉防己堿對(duì)獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白的調(diào)控研究顯示單純應(yīng)用DDP的模型組，其P-gp蛋白的表達(dá)為13.135.33，而粉防己堿無(wú)毒性高低劑量組其表達(dá)分別降為7.413.35和9.222.36，且其抑制率顯著提高,揭示逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制可能與其降低P-gp蛋白的表達(dá)有關(guān)。 另?yè)?jù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道，中

6、藥三氧化二砷、ECCG、甲基蓮心堿、補(bǔ)骨脂素等也可下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)而達(dá)到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用710。2 多藥耐藥的非經(jīng)典途徑 由MDR1基因編碼的P-gp蛋白過(guò)度表達(dá)介導(dǎo)的藥物外排是產(chǎn)生MDR的經(jīng)典機(jī)制，除此外，MDR還與多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、細(xì)胞凋亡等多種非經(jīng)典機(jī)制密切相關(guān)。2.1 MRP介導(dǎo)的多藥耐藥多藥耐藥蛋白1(MRP1)屬于ATP結(jié)合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)運(yùn)輸?shù)鞍准易宄蓡T，它可以通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)多種抗腫瘤藥，從而限制抗腫瘤藥進(jìn)入細(xì)胞11。 徐萌等12用漢防己甲素逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)

7、漢防己甲素處理12，24，36 h后MRP蛋白表達(dá)量的表達(dá)分別為32.214.79，30.564.58，25.557.58，而對(duì)照組則分別為53.427.42，52.9810.35，60.989.37，差異有非常顯著性意義(P0.01)，提示漢防己甲素可以下調(diào)肺癌耐藥細(xì)胞MRP蛋白表達(dá)。成靜等13對(duì)三氧化二砷研究顯示MRPmRNA在耐藥細(xì)胞A549/R中均呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，A549/R細(xì)胞經(jīng)濃度為0.150，0.375，0.750 mol/L 的As2O3作用48h后，MRPmRNA的表達(dá)水平呈不同程度的降低，且隨著其濃度增加，MRPmRNA表達(dá)水平逐漸下降。 另外，王利等14葛根素逆轉(zhuǎn)人胃癌裸鼠

8、原位移植瘤多藥耐藥性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究顯示5-FU聯(lián)合葛根素組MRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為37.5%，顯著低于對(duì)照組生理鹽水組（82.5%）及單純5-FU組（74%）（P0.05），提示其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用與其下調(diào)MRP蛋白陽(yáng)性表達(dá)率有關(guān)。2.2 谷胱甘肽介導(dǎo)的多藥耐藥多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜多樣，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的增強(qiáng)是產(chǎn)生多藥耐藥的重要機(jī)制。肖希斌等15的研究顯示K562/A02細(xì)胞GST-的PCR擴(kuò)增帶亮度較強(qiáng)，而經(jīng)甲基蓮心堿(Nef)處理組PCR擴(kuò)增帶亮度明顯減弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-基因的mRNA轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果亦顯示，未經(jīng)藥物處理的K562/A02組的蛋白雜交

9、帶，明顯強(qiáng)于K562/A02+Nef組，表明Nef能抑制GST-蛋白的表達(dá)。 苗立云等16青蒿琥酯逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥性機(jī)理的研究顯示K562/A02細(xì)胞內(nèi)GSH呈現(xiàn)高表達(dá)(P0.05)，經(jīng)100g/ml 青蒿琥酯處理48 h后，K562/A02細(xì)胞內(nèi)GSH含量較藥物處理前明顯降低(P0.05)。2.3 核轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的多藥耐藥核轉(zhuǎn)錄因子（NF-B）在細(xì)胞增殖和凋亡中起關(guān)鍵調(diào)控作用，而目前有研究顯示其在多藥耐藥的產(chǎn)生中也扮演著重要的角色，陳進(jìn)偉等17K562/A02耐藥細(xì)胞NF-B活性測(cè)定的研究發(fā)現(xiàn)活化后K562/A02細(xì)胞NF-B表達(dá)明顯增強(qiáng)(P 0.01)，提示K562/A02細(xì)胞

10、耐藥可能與增高的NF-B活性相關(guān)，其研究顯示經(jīng)無(wú)毒性劑量葛根素處理后的K562/A02細(xì)胞的NF-B活性較未經(jīng)葛根素處理前明顯降低(P0.01)。宋玉成等18對(duì)鹽酸千金藤素（CH）逆轉(zhuǎn)EAC/ADR細(xì)胞多藥耐藥性的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞中活性高于敏感細(xì)胞 (P0.05)，化療藥ADR可激活耐藥細(xì)胞的NF-B活性，對(duì)敏感細(xì)胞無(wú)影響，其研究顯示CH不但可抑制EAC/ADR細(xì)胞中NF-B持續(xù)性活性，而且可抑制ADR對(duì)NF-B的激活，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示荷瘤小鼠EAC/ADR細(xì)胞核內(nèi)NF-B呈持續(xù)性活化狀態(tài)，ADR作用2h后誘導(dǎo)NF-B活化，CH與ADR合用2h后，可明顯抑制ADR對(duì)NF-B活性的誘導(dǎo)。2.4

11、LRP及拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的多藥耐藥肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）與拓?fù)洚悩?gòu)酶亦是近期研究較多的耐藥介導(dǎo)介質(zhì)。LRP作用機(jī)制是通過(guò)降低藥物的核質(zhì)分布比率和通過(guò)囊泡、胞吐作用將藥物排出細(xì)胞19。拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topo)是調(diào)控DNA拓?fù)錉顟B(tài)的酶類，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，Topo質(zhì)和量的改變會(huì)直接影響與DNA的結(jié)合，導(dǎo)致藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的裂解復(fù)合物形成減少，從而導(dǎo)致耐藥。孫付軍等20研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可以逆轉(zhuǎn)小鼠S180腫瘤細(xì)胞獲得性多藥耐藥，其研究表明經(jīng)其誘導(dǎo)后LRP、TOPO小鼠瘤體中可呈穩(wěn)定高表達(dá)，而給予小鼠100mg/kg苦參堿后的瘤體中兩種蛋白的表達(dá)率分別降低為（10.766.28）%和（8.584.1）%，與對(duì)照組相

12、比呈現(xiàn)顯著性（P0.01），其逆轉(zhuǎn)作用可能與其調(diào)控LRP及Topo的表達(dá)有關(guān)。季旭明等21對(duì)溫下方逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的多藥耐藥的研究發(fā)現(xiàn)A549/DDP細(xì)胞MRP呈現(xiàn)高表達(dá)，A549/DDP細(xì)胞經(jīng)溫下方含藥血清組處理24 h后，含藥血清組+DDP能明顯降低LRP表達(dá)，且與對(duì)照組比較有顯著性差異(P0.05)。蓋曉東等22柴胡逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌多藥耐藥的研究表明，經(jīng)柴胡作用后，TopomRNA升高，揭示其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用可能與調(diào)控TopomRNA基因表達(dá)有關(guān)。2.5 降低細(xì)胞內(nèi)CA2+濃度Ca2+是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌和傳導(dǎo)等機(jī)制的信使，自從Tsuruo等初次發(fā)現(xiàn)MDR表型的腫瘤細(xì)

13、胞內(nèi)游離Ca2+濃度增高以來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)證明耐藥腫瘤細(xì)胞中Ca2+濃度高于非耐藥腫瘤細(xì)胞，又有學(xué)者證實(shí)鈣拮抗劑可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性。蔡宇等23補(bǔ)骨脂素對(duì)HL60/HT耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)及對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響研究發(fā)現(xiàn)耐藥株HL60/HT細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯高于敏感株HL60(P0.01),而加用補(bǔ)骨脂素1-20 mol/L,尤其補(bǔ)骨脂素10和20 mol/L 兩個(gè)劑量，Ca2+濃度與作用時(shí)間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，該動(dòng)態(tài)結(jié)果說(shuō)明了補(bǔ)骨脂素具有影響耐藥細(xì)胞HL60/HT內(nèi)Ca2+濃度趨勢(shì)。王金華等24用粉防己堿逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細(xì)胞的作用顯示粉防己堿（Tet）與VCR合用處理耐藥細(xì)胞，可明顯地

14、增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣的含量，用Tet 20 umol/L+VCR 5 umol/L處理MCF-7耐藥細(xì)胞12 h，可使細(xì)胞內(nèi)的游離鈣比對(duì)照組增加2.6倍。2.6 凋亡相關(guān)基因介導(dǎo)的多藥耐藥Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控物，其中Bcl-2相對(duì)分子量為26 000,蛋白水平與腫瘤細(xì)胞的MDR相一致，其過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞凋亡受抑制，同時(shí)對(duì)阿霉素、長(zhǎng)春新堿、順鉑等多種化療藥物耐藥，其機(jī)制可能在于其產(chǎn)物可以穩(wěn)定細(xì)胞生存，抑制多種因素，包括化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥25，26。 艾小紅等27甲基蓮心堿逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/thermotolerance細(xì)胞對(duì)阿霉素耐受性的作用發(fā)現(xiàn)HepG2/t

15、hermotolerance細(xì)胞較HepG2細(xì)胞高表達(dá)Bcl-2蛋白，而甲基蓮心堿能夠下調(diào)HepG2/thermotolerance細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)。鐘陸行等28參芪扶正注射液對(duì)K562/ADM多藥耐藥的影響研究顯示K562/ADM 細(xì)胞Bcl-2基因呈現(xiàn)高表達(dá)，經(jīng)10 l/ml參芪處理后其表達(dá)為68.393.89,而正常對(duì)照組則高達(dá)(93.822.32)，由此可見(jiàn)參芪扶正注射液可以明顯下調(diào)Bcl-2表達(dá)率。3 多靶點(diǎn)作用逆轉(zhuǎn)機(jī)制 整體觀念是中醫(yī)的基本特點(diǎn)之一。從現(xiàn)代研究的角度看，可以體現(xiàn)在中藥治療腫瘤的多靶點(diǎn)作用。在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥中，中藥的作用機(jī)制也并非只局限于某一點(diǎn)，而是一個(gè)綜合的作用,

16、這也正是中藥在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究中越來(lái)越受到人們重視的原因之一。3.1 體外實(shí)驗(yàn)研究侯華新等29用板藍(lán)根高級(jí)不飽和脂肪酸對(duì)耐藥肝癌細(xì)胞株BEL-7404/ADM逆轉(zhuǎn)作用實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)（與Bel-7404相比，P0.01），經(jīng)ADM及無(wú)細(xì)胞毒性濃度的板藍(lán)根聯(lián)合作用的Bel-7404/ADM 細(xì)胞內(nèi)ADM含量較單獨(dú)ADM作用時(shí)明顯增加(P0.01),提示其作用機(jī)制可能與其同時(shí)降低P-gp、MRP蛋白的表達(dá)有關(guān)。王利等30欖香烯對(duì)耐藥胃癌細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SGC7901/VCR細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)均有P-gp和MRP表達(dá)，為強(qiáng)陽(yáng)性染色”+“，加入欖香烯后SGC7901/VCR細(xì)胞也存在P-gP和MRP的表達(dá)，但為”+“至“+”。蓋曉東等31柴胡逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞癌多藥耐藥作用與相關(guān)機(jī)制的研究，結(jié)果表明柴胡逆轉(zhuǎn)Be17402細(xì)胞多藥耐藥顯示經(jīng)柴胡作用后，可明顯的抑制Be17402細(xì)胞MDR1/mRNA和P-gp的表達(dá)，升高TopomRNA水平，揭示其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用可能與調(diào)控多種耐藥基因有關(guān)。3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究董琳等32甲基蓮心堿對(duì)胃癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用研究發(fā)現(xiàn)P-gp、MRP在 SGC7901/VCR細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)（P0.05），經(jīng)10 mol/L Nef處