HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素的含量

1、在我國(guó) , 鬼臼類藥材包括小檗科鬼臼亞科 Dysosma versi-pellis (Hance. M.Cheng Podophylloideae 桃兒七屬 Sinopodop-hyllum 、 山荷葉屬 Diphylleia 、 八角蓮屬 Dysosma 等 3個(gè)屬 , 各屬 代表藥用植物分別有桃兒七 S. hexandrum (S. emodi (Wall. ex Royle Ying 、 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li 以及八角蓮 D. versipellis (Hance M.Cheng 。 鬼臼類藥材主要以干燥根莖入 藥 1。 主要成分鬼臼毒素為芳基四氫萘類木質(zhì)

2、素 , 具有抗腫 瘤 、 抗病毒等活性 2, 以及祛風(fēng)除濕 、 活血止痛 、 鎮(zhèn)咳平喘等功 能 3。 鬼臼類藥材因其多種植物來源而導(dǎo)致異名繁多 、 品種混 用現(xiàn)象比較嚴(yán)重 , 屢有因用法用量問題而引發(fā)中毒事件 4。 鬼 臼毒素為其主要毒性成分 , 不同產(chǎn)地藥材中鬼臼毒素含量差 異較大 , 鬼臼類藥材飲片中毒劑量從幾克到幾十克不等 5。 為 了比較不同產(chǎn)地鬼臼類藥材的毒性大小 , 本試驗(yàn)用高效液相 色譜 (HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素的含量 , 以為臨床安全合理用藥提供依據(jù) 。1儀器與試藥Ultimate 3000型 HPLC 儀 , 包括四元梯度泵 、 自動(dòng)進(jìn)樣器 、紫外檢測(cè)器

3、 (美國(guó)戴安公司 ; Chromeleon 軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 。 甲醇為色譜純 , 水為純化水 , 氯仿 、 磷酸二氫鉀為分析 純 ; 鬼 臼 毒 素 對(duì) 照 品 (中 國(guó) 藥 品 生 物 制 品 檢 定 所 , 批 號(hào) : 111645-200301 ; 鬼臼類藥材分別采于湖北 、 重慶 、 云南等 地 , 由鄖陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系生藥教研室陳吉炎教授提供并鑒定 為真品 。2方法與結(jié)果2. 1供試品溶液的制備精密稱取各樣品粉末 (過 2號(hào)篩 1g , 置于 250mL 錐形瓶 中 , 加氯仿 50mL , 回流提取 1h , 過濾 , 濾液揮干 , 殘?jiān)眉状?溶解 , 定容于 50mL 容量瓶中

4、 , 備用 。2. 2對(duì)照品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥 12h 的鬼臼毒 素對(duì)照品 10mg , 置于 10mL 容量瓶中 , 用甲醇溶解并稀釋至 刻度 , 搖勻 , 備用 。2. 3色譜條件色譜柱 :Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m , 前加預(yù)柱 (10mm×4. 6mm ; 檢測(cè)波長(zhǎng) :290nm ; 柱溫 :30 ; 流動(dòng)相 :甲 醇 -0. 1mol ·L -1磷酸二氫鉀 (45 55 ; 流速 :1. 0mL ·min -1。 色譜 圖見圖 1。HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素的含

5、量 趙祖興 1, 2*, 楊光義 2#, 陳吉炎 2, 葉 方 2, 郝新才 2(1. 湖北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 , 武漢市 430061; 2. 鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬 太和醫(yī)院 , 十堰市 442000中圖分類號(hào) R 284. 1; R 927. 2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2010 19-1784-02摘 要 目的 :建立以高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地鬼臼類藥材中鬼臼毒素含量的方法 。 方法 :色譜柱為 Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m , 流動(dòng)相為甲醇 -0. 1mol ·L -1磷酸二氫鉀 (45 55 , 檢測(cè)波長(zhǎng)為 290n

6、m , 柱溫為 30 , 流速為 1. 0mL ·min -1。 結(jié)果 :不 同產(chǎn)地鬼臼類藥材所含鬼臼毒素的量差異較大 , 其中以產(chǎn)自湖北竹溪的山荷葉含量最高 , 產(chǎn)自湖北房縣的六角蓮含量最低 (二者 含量相差近 4倍 。 結(jié)論 :不同產(chǎn)地 、 不同品種的鬼臼類藥材中鬼臼毒素含量不同 , 故各地的中毒劑量不同 。關(guān)鍵詞 鬼臼毒素 ; 高效液相色譜法 ; 鬼臼亞科 ; 含量測(cè)定Content Determination of Podophyllotoxin in Podophylloideae from Different Habitats by HPLCZHAO Zu-xing (S

7、chool of Pharmacy , Hubei College of Traditional Chinese Medicine , Wuhai 430061, China ZHAO Zu-xing , YANG Guang-yi , CHEN Ji-yan , YE Fang , HAO Xin-cai (Taihe Hospital of Yunyang Medical College , Shiyan 442000, China ABSTRACT OBJECTIVE :To establish HPLC method for the content determination of p

8、odophyllotoxin in podophylloideae col-lected from different habitats. METHODS :Diamonsil C 18(250mm×4. 6mm , 5m was used with methanol-0. 1mol ·L -1KH 2PO 4 (45 55 as mobile phase at a flow rate of 1. 0mL ·min -1. The detection wavelength was set at 290nm and column temperature was 30

9、 . RESULTS :The contents of podophyllotoxin in podophylloideae form different habitats were different from one another , among which the content of podophyllotoxin in Diphylleia sinensis from Zhuxi in Hubei province was the highest while that in Dys-osma pleiantha from Fangxian in Hubei province was

10、 the lowest (difference between two kinds of plants of nearly 4times . CON-CLUSION :The contents of podophyllotoxin are different because of the different species and regions. The dose of podophyllotoxin which induce toxicosis is different.KEY WORDS Podophyllotoxin ; HPLC ; Podophylloideae ; Content

11、 determination*碩士研究生 。 研究方向 :中藥鑒定與新制劑開發(fā) 。 E-mail :sa-wyer 988#通訊作者 :講師 , 主管藥師 , 博士 。 研究方向 :中藥資源開發(fā)和新藥開發(fā) 。 E-mail :ygy 996Pharmacy V ol. 21No. 中國(guó)藥房 201021卷第 19期 年第 19Pharmacy 2010V ol. 212. 4方法學(xué)考察2. 4. 1線性關(guān)系考察 :精密量取鬼臼毒素對(duì)照品溶液 1. 0、 2. 0、3. 0、 4. 0、 5. 0mL , 分別置于 10mL 容量瓶中 , 加甲醇稀釋至刻 度 , 搖勻 , 按 “ 2. 3” 項(xiàng)

12、下色譜條件測(cè)定峰面積 。 以峰面積積分值 (Y 為縱坐標(biāo) , 鬼臼毒素含量 (X 為橫坐標(biāo) , 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 得 回歸方程為 Y =85. 2859X +1. 6881(r =0. 9998 。 結(jié)果表明 , 鬼 臼毒素的進(jìn)樣量在 0. 1561. 3mg ·mL -1的范圍內(nèi)與峰面積積 分值呈良好的線性關(guān)系 。 2. 4. 2精密度試驗(yàn) :精密吸取鬼臼毒素對(duì)照品溶液 10L , 重復(fù)進(jìn)樣 5次 , 測(cè)定 。 結(jié)果 , RSD =0. 0026%, 表明儀器精密度良好 。 2. 4. 3穩(wěn)定性試驗(yàn) :取供試品溶液 , 分別于配制后 0、 2、 5、 8、 10h 進(jìn)樣 。 結(jié)果

13、, RSD =0. 0114%(n =5 , 表明供試品溶液在 10h 內(nèi)檢測(cè)對(duì)結(jié)果無影響 , 穩(wěn)定性良好 。2. 4. 4重復(fù)性試驗(yàn) :按 “ 2. 5” 項(xiàng)下方法操作 , 對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定 6次 , 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10L 。 結(jié) 果 , RSD =0. 42%, 表明方法重復(fù)性良好 。 2. 4. 5加樣回收率試驗(yàn) :精密稱取已測(cè)含量的樣品 , 分別精密加入低 、 中 、 高濃度的對(duì)照品 , 按 “ 2. 1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液 , 按上述色譜條件測(cè)定 。 結(jié)果 , 其平均回收率為 100. 06%, RSD =1. 99%, 說明該測(cè)定方法可行 。 加樣回

14、收率試驗(yàn)結(jié)果見表 1。表 1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n =9 Tab 1Results of recovery test (n =9取樣量 /g0. 48090. 48090. 48090. 58030. 58030. 58030. 59860. 59860. 5986樣品含量 /mg14. 614. 614. 617. 717. 717. 718. 218. 218. 2加入量/mg12. 612. 612. 617. 117. 117. 120. 120. 120. 1測(cè)得量 /mg27. 127. 627. 135. 334. 334. 738. 638. 138. 1回收率 /%99.

15、21103. 1799. 21102. 9297. 0899. 42101. 4999. 0099. 00/%100. 06RSD /%1. 992. 5樣品含量測(cè)定精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各 10L 進(jìn)樣 , 以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算鬼臼毒素含量 。 藥材樣品來源 、 編號(hào)及鬼臼毒素 含量測(cè)定結(jié)果見表 2。05101520253035404550minB05101520253035404550min A圖 1高效液相色譜圖A. 鬼臼毒素對(duì)照品 ; B. 供試品Fig 1HPLC chromatogramsA. podophyllotoxin control ; B. test sample表

16、2藥材樣品來源 、 編號(hào)及鬼臼毒素含量測(cè)定結(jié)果Tab 2Source and number of podophylloideae and content determination of it編號(hào)12345678910樣品來源 購自湖北十堰 , 產(chǎn)地重慶 購自湖北鄖縣白桑 , 產(chǎn)地湖北竹溪 購自湖北十堰 , 產(chǎn)地云南 購自湖北十堰 , 產(chǎn)地重慶 購自湖北房縣 , 產(chǎn)地湖北房縣采自湖北房縣橋上鄉(xiāng)三座淹村大峽溝 購自湖北十堰 , 產(chǎn)地重慶 清大藥業(yè)代購 , 產(chǎn)地湖北竹溪 清大藥業(yè)代購 , 產(chǎn)地湖北竹溪 購自湖北十堰 , 產(chǎn)地重慶鑒定結(jié)果八角蓮 D. versipellis M. Cheng 南方山

17、荷葉 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li. 八角蓮 D. versipellis M. Cheng 八角蓮 D. versipellis M. Cheng 六角蓮 D. pleiantha Woods. 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li. 南方山荷葉 D. sinensis H. L. Li.含量 /g·g -10. 14180. 53710. 39820. 16030. 15360. 139

18、60. 33800. 31440. 29440. 4709保留時(shí)間 /min33. 44333. 39633. 04033. 57433. 29633. 12033. 35333. 11632. 79033. 2963討論10批樣品的測(cè)定結(jié)果表明 , 鬼臼毒素含量最多的依次是產(chǎn)地湖北竹溪的南方山荷葉 、 產(chǎn)地重慶的南方山荷葉 、 產(chǎn)地云 南的南方山荷葉 , 含量最少的是產(chǎn)地湖北房縣的六角蓮 。不同產(chǎn)地 、 不同品種的鬼臼類藥材所含鬼臼毒素差異較 大 , 故用生藥材入藥時(shí) , 各種藥材的中毒劑量也有差異 。參考文獻(xiàn)1馬紹賓 , 胡志浩 . 小檗科鬼臼亞科的地理分布與系統(tǒng)發(fā)育 J.云南植物研究 , 1997, 19(1 :48. 2尚明英 , 徐珞珊 , 李萍 , 等 . 鬼臼類中藥及其木脂素類成分的藥效學(xué)研究