微生物檢測菌落總數(shù)測定方法

1、微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)的測定1 原理微生物活體數(shù)量的測定方法，常用平板培養(yǎng)計數(shù)法。它是通過將樣品制成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液，再取一定的稀釋液接種，使其均勻分布于培養(yǎng)皿中特定的培養(yǎng)基內(nèi)，最后根據(jù)在平板上長出的菌落數(shù)計算出每克（或mL）樣品中的活菌數(shù)量。2 材料和儀器 平皿：90mm。2.2 無菌錐形瓶：容量250mL，500 mL。2.3 無菌吸管：1mL（具0.01mL個度）,10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.4 滅菌鍋。2.5 恒溫培養(yǎng)箱2.6 涂棒。2.7 酒精燈。2.8 超凈工作臺。2.9 磁力攪拌器。0 漩渦振蕩器3 檢驗程序 菌落總數(shù)的檢驗程序見下圖。檢樣10

2、g樣品+90mL無菌生理水，均質(zhì) 10倍系列稀釋 選擇至少3個適宜樣品稀釋均液 方法 方法各取1mL分別加入無菌培養(yǎng)皿中，每皿中加入15mL20mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。在培養(yǎng)皿中加入15mL20mL平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，凝固。然后在每皿中加入0.2mL樣品稀釋液，涂布均勻。 在36±1倒置培養(yǎng)2448小時 計算各平板菌落數(shù)計算菌落總數(shù)4 操作步驟4.1 培養(yǎng)基和試劑的配制 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（最常用）牛肉膏 5g蛋白胨 10g氯化鈉 5g瓊脂 20g蒸餾水 1LpH 7.07.2將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH值，分裝錐形瓶中，121高壓滅菌30分鐘。

3、 無菌生理鹽水的配制：稱取8.5g氯化鈉溶解于1000mL蒸餾水中，121高壓滅菌30分鐘。4.2 樣品的稀釋： 固體樣品： 稱取10g固體樣品置于盛有90mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中（內(nèi)裝數(shù)粒無菌玻璃珠），在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，制成1：10的樣品均液，即10-1稀釋液。 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品均液1mL（吸取前需要搖勻1：10稀釋液），緩慢加入盛有9mL無菌生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不能觸及 稀釋液面），用漩渦振蕩器振蕩，混合均勻，制成1：100的樣品稀釋均液。 按照4.2.2操作程序，制備10倍系列樣品稀釋液，每遞增稀釋一次

4、，換用一次1mL無菌吸管或吸頭。 根據(jù)對樣品活菌數(shù)量的估計，選擇34個適宜稀釋度的樣品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀釋液）。4.2 平板接種與培養(yǎng)接種方法1：用1mL無菌吸管或微量移液器分別吸取不同稀釋度的菌懸液1mL于一個無菌培養(yǎng)皿中（每個稀釋度做三個重復(fù)），再在培養(yǎng)皿中分別倒入1015mL已融化并冷卻至4550的培養(yǎng)基，蓋好平皿蓋子，趁熱輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混合均勻，冷凝后在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24，培養(yǎng)溫度為36±1。同時以無菌水作空白對照。注：比如1000億CFU樣品稀釋梯度可選擇為：10-8，10-9，10-10。接種方法2：用1mL無菌吸

5、管或微量移液器吸取稀釋液均液于計數(shù)培養(yǎng)基平板上，將稀釋液涂布均勻，吸附，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24，培養(yǎng)溫度為36±1。同時以無菌水作空白對照。（計算時需要把0.2mL的倍數(shù)也計算在稀釋倍數(shù)內(nèi)）注：比如1000億CFU樣品稀釋梯度可選擇為：10-7，10-8，10-9。 菌落計數(shù) 可用肉眼觀察，必要時借用放大鏡或菌落計數(shù)器，以防遺漏。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units,CFU）表示4.3.1 選取菌落數(shù)在30300之間，無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計。每個稀

6、釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用3個平行平板的平均數(shù)。4.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效，需重新測定。5 菌落總數(shù)的計算方法 若只有一個稀釋度的菌落數(shù)30100的適宜計數(shù)范圍之間時，計算三個平行的平均值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克中菌落總數(shù)結(jié)果。5.2 若有2個稀釋度，其平均菌落數(shù)在30100的適宜計數(shù)范圍之間，應(yīng)按兩者菌落數(shù)之比值來決定；若其比例小于2應(yīng)計數(shù)兩者的平均數(shù)；若大于2則計數(shù)其中稀釋度較小的菌落總數(shù)。 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均不在30100之間時，其中一部分小于30或大于100時，則以最接近30或100的平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)計算。5.4 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)離30100范圍較遠(yuǎn)時，建議選擇適合的