大黃素、黃芪多糖在體外對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用

1、大黃素、黃芪多糖在體外對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用         08-01-15 11:18:00     編輯：studa20                   作者：黨雙鎖張正國(guó)張欣宋平邊靜程延安 【摘要】  目的 體外觀察大黃素、黃芪多糖單用與聯(lián)合應(yīng)用抗HBV的作用。方法 以Hep

2、G2.2.15細(xì)胞為研究模型，選用干擾素、拉米夫定為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察培養(yǎng)液中加入不同濃度大黃素、黃芪多糖及兩藥聯(lián)合應(yīng)用抗HBV作用的效果。采用Taq man熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞上清HBV DNA，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液HBsAg、HBeAg水平的變化。采用MTT法觀察它們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果 大黃素的3個(gè)劑量組(12.5、25.0、50.0mg/L)和所觀察的時(shí)間點(diǎn)(3、6、9d)對(duì)HBV DNA、HBsAg、HBeAg表現(xiàn)出劑量與時(shí)間依賴的抑制作用(P<0.05)。大黃素對(duì)HBV DNA抑制的半數(shù)抑制濃度為21mg/L，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞半數(shù)細(xì)胞毒性濃度為40.66mg

3、/L，治療指數(shù)為1.94。同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖各劑量組對(duì)HBV無(wú)明顯的抑制作用(P>0.05)。大黃素、黃芪多糖聯(lián)合應(yīng)用在療效方面無(wú)明顯的交互作用(P>0.05)。結(jié)論 大黃素在體外對(duì)HBV具有一定的抑制作用，黃芪多糖無(wú)明顯抑制HBV的作用，兩藥聯(lián)用無(wú)明顯協(xié)同抗HBV的作用。 【關(guān)鍵詞】  大黃素；黃芪多糖；乙型肝炎病毒；細(xì)胞培養(yǎng)Inhibition on hepatitis B virus by emodinand astragalus polysaccharides in vitroABSTRACT: Objective  To investigate the

4、effects of emodin, astragalus polysaccharides (APS) on hepatitis B virus (HBV) in vitro. Methods  Human hepatoma G2.2.15 cell line stably expressed hepatitis B virus particles in culture. The cells were exposed to different concentrations of emodin, APS, interferon , and lamivudin, respectively

5、. Realtime PCR was applied to quantify extracellular HBV DNA and ELISA was applied to assess HBsAg and HBeAg. MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of drugs. Results  The results showed that exposure of HepG2.2.15 cells to emodin resulted in a time and concentrationdependent inhibitio

6、n of HBV DNA replication and HBsAg, HBeAg secretion (P<0.05). IC50 to HBV DNA was 21mg/L, CC50 to HepG2.2.15 cells was 40.66mg/L, and the treatment index (TI) was 1.94. APS could not restrain HBV DNA, HBsAg and HBeAg obviously in vitro (P>0.05). The interaction was not significant between emod

7、in and APS (P>0.05). Conclusion  Emodin had time and concentrationdependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Coadministration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.KEY WORDS: emodin; astra

8、galus polysaccharides; hepatitis B virus; cell culture病毒性乙型肝炎的治療關(guān)鍵是抗病毒治療。中藥在肝病治療中起著很重要的作用。大黃和黃芪是治療乙肝復(fù)方中最常用到的兩味中藥。近年來(lái)，研究證明它們對(duì)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)有一定的治療作用。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效單體，黃芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)是黃芪的主要有效成分。本研究以HepG2.2.15細(xì)胞為體外HBV復(fù)制模型，初步觀察大黃素、黃芪多糖單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HBV的抑制作用。1  材

9、料與方法1.1  藥物  大黃素(純度950g/L購(gòu)自西安崇信天然添加劑有限公司，由國(guó)家中藥鑒定所鑒定，批文號(hào)：25100806)，黃芪多糖(純度為600g/L，西安鴻生生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國(guó)家中藥鑒定所鑒定，批號(hào)：040618)，干擾素(購(gòu)自羅氏公司，批號(hào)：010801I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院提供。1.2  試劑及主要儀器  噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，二甲基亞砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA檢測(cè)試劑盒(上海華泰生物工程公司)，HBV DNA提取及擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒(廣州

10、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，和PE7700型自動(dòng)熒光PCR儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)。1.3  細(xì)胞  HepG2.2.15細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍感染病診療中心惠贈(zèng)，可穩(wěn)定表達(dá)乙肝病毒蛋白并分泌病毒顆粒。培養(yǎng)液為DMEM(Gibco)，含200mL/L胎牛血清(杭州四季青生物材料公司)、0.3g/L谷氨酰胺(Gibco)，1×105u/L青鏈霉素(華北制藥廠)，碳酸氫鈉調(diào)整pH值到7.2。消化細(xì)胞用2.5g/L胰蛋白酶(Gibco)。1.4  細(xì)胞培養(yǎng)  2.5g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種于9

11、6孔板，每孔200L，于37、50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，換培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5  實(shí)驗(yàn)分組  實(shí)驗(yàn)共分3大組，17個(gè)劑量組，分組如下：陽(yáng)性對(duì)照組分別為干擾素(INF)、拉米夫定，各設(shè)3個(gè)劑量組(125000、250000、500000u/L INF ；0.025、0.05、0.1mol/L 3TC)；實(shí)驗(yàn)組為3個(gè)組，即大黃素組(12.5、25.0、50.0mg/L)，黃芪多糖組(120、240、480g/L)，聯(lián)合用藥組(25.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，50.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，25.0mg/L大黃素240g/L黃芪

12、多糖，50.0mg/L大黃素240g/L黃芪多糖)；陰性對(duì)照組即生理鹽水組，用等體積生理鹽水加入。實(shí)驗(yàn)中除陰性對(duì)照組設(shè)10個(gè)復(fù)孔外，其余每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，用含藥物培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。每3d換同樣濃度含藥培養(yǎng)液及對(duì)照培養(yǎng)液1次。各孔在3、6、9d時(shí)，將吸去的上清液置于-20冰箱保存待檢。1.6  MTT實(shí)驗(yàn)  加藥第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20L，37培養(yǎng)4h，棄上清后，每孔加入150L DMSO，震蕩10min，測(cè)定570nm吸光度。按下列公式計(jì)算細(xì)胞的抑制百分率。細(xì)胞抑制百分率=陰性對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值陰性對(duì)照組平均A值×100%按下

13、列公式計(jì)算藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)。CC50= lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C    (B=lg<50%藥物濃度，C=lg2)1.7  熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞外HBV DNA1   按照達(dá)安基因股份有限公司HBV核酸提取與核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。兩引物序列分別為P15ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3，P25ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3，熒光探針序列為5TGGCTAGTTTACTAGTGCCATT

14、TG3。各反應(yīng)管放入PE7700自動(dòng)熒光PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：93 2min預(yù)變性，然后93 45s到55 1min循環(huán)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再按93 30s到55 45s循環(huán)擴(kuò)增，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析出HBV DNA定量結(jié)果。按照下面公式計(jì)算藥物對(duì)HBV DNA的抑制率。    HBV DNA抑制率=陰性對(duì)照組HBV DNA拷貝數(shù)-實(shí)驗(yàn)組HBV DNA拷貝數(shù)陰性對(duì)照組HBV DNA拷貝數(shù)×100%    按下列公式計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。  IC50=lg-1B+0.5-<50%抑制百分率>50%抑制百分率-<50%抑制百分率×C    (B= lg <50%藥物濃度，C=lg 稀釋倍數(shù)的倒數(shù))    治療指數(shù)(TI)= CC50/IC50。1.8  HBsAg和HBeAg的測(cè)定  使用雙抗體加心ELESA法1。