實驗六蛋黃總膽固醇的測定(鄰苯二甲醛法)

1、實驗六 蛋黃總膽固醇的測定（鄰苯二甲醛法）一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)分光光度計的原理及操作。2、學(xué)習(xí)用分光光度法測定蛋黃中總膽固醇（脂肪）含量及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 二、基本原理膽固醇及其酯在硫酸存在下與鄰苯二甲醛作用，產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，此物質(zhì)在550nm由最大吸收值，可用比色法測定。膽固醇含量在400mg/100ml之內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。本法操作簡便，靈敏、穩(wěn)定。實驗相關(guān)原理根據(jù)物質(zhì)對光的吸收特征和吸收強(qiáng)度，對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法，稱為分光光度法(spectrophotometry)。該法具有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度，分析手續(xù)較簡便快速，儀器設(shè)備也不復(fù)雜，故應(yīng)用很廣。 吸光度與液層厚度和溶液

2、濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。 吸光系數(shù)的大小，取決于物質(zhì)(溶質(zhì)、溶劑)的本性和光的波長。 1. 物質(zhì)不同，則吸光系數(shù)不同，所以吸光系數(shù)可作為物質(zhì)的特性常數(shù)。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數(shù)來衡量顯色反應(yīng)的靈敏度，值越大，靈敏度越高。 2. 溶劑不同，其吸光系數(shù)亦不同。3. 光的波長不同，其吸光系數(shù)亦不同。如將不同波長的單色光依次通過被分析物質(zhì)，分別測得吸光度，然后繪制吸光度波長曲線，稱為吸收曲線(absorption curve)，吸收曲線上有極大值的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對應(yīng)的波長，稱為最大吸收波長，以符號max表示 ，這是物質(zhì)定性的依據(jù)之一。4.單

3、色光的純度也影響吸光系數(shù)。單色光越純，即經(jīng)單色器分光后的波長范圍越窄，其吸光系數(shù)越大。定量方法：1、吸光系數(shù)法 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法 不是任何情況下都能適用的。特別是在單色光不純的情況下，測得的吸光度值可以隨所用儀器不同而在一個相當(dāng)大的幅度內(nèi)變化不定，若用吸光系數(shù)換算成濃度，則將產(chǎn)生很大誤差。 先配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在測定條件相同情況下，分別測定其吸光度，然后以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制AC關(guān)系圖，在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品溶液的濃度。 3、對照法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）在測定條件相同的情況下，分

4、別測定其吸光度。（3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制A-C關(guān)系圖。（4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出濃度。定性方法： 將一系列不同波長的單色光，照射到含待測組分的溶液，可測得相應(yīng)的一系列吸光度。如果以吸光度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖，便可得到該待測物質(zhì)的吸收曲線。由于每一種物質(zhì)均有其特征的吸收曲線，故可與其標(biāo)準(zhǔn)品比較而定性。但在實際工作中常用max 和來定性，max可從吸收曲線中吸收峰所對應(yīng)的波長直接找出；通常需配制待 測物質(zhì)三種不同濃度的溶液，于1cm吸收池中，在max處分別測定其吸光度，根據(jù)A=bc，即=A/bc，計算出，將三次結(jié)果平均，即得該

5、物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)。三、試劑1. 鄰苯二甲醛試劑2. 90%醋酸3. 混合酸：等體積濃硫酸+等體積90%醋酸mg/ml標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液5. 小牛血清四、操作步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： ，蒸餾水0.01ml，加入4ml混合酸，震蕩混勻，10分鐘后于550nm測定吸光值，以膽固醇量mg/100ml為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品測定： 取2支試管，編號后加入醋酸0.4ml，血清0.01ml，再按照下表加入試劑。對照樣品鄰苯二甲醛0無水乙醇0混合酸3、加畢，混勻，靜置10分鐘后，以對照管校0于550nm測定吸光值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度。五、實驗結(jié)果試管編號標(biāo)準(zhǔn)膽固醇（6mg/mL）吸光度值10mL2345樣品吸光度因為K為如圖所畫直線斜率，所以樣品中的膽固醇量為：A/K2.10(mg/100mL)由于樣品中的蛋黃含量為600mg/