抗乙酰膽堿受體單鏈抗體酵母表達的特性鑒定

1、    【摘要】  目的探討畢赤酵母GS115表達的重癥肌無力單鏈抗體A7的一般特性及與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的結(jié)合特異性方法采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡試驗，檢測已經(jīng)轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中的重癥肌無力重組載體pPIC9KScFv A7表達的單鏈抗體A7蛋白的分子質(zhì)量；應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)確定表達蛋白與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的親和性結(jié)果畢赤酵母GS115培養(yǎng)上清液中有目的蛋白的表達，分子質(zhì)量約為44ku；間接免疫熒光試驗顯示，在大鼠肋間肌細胞間有熒光出現(xiàn)結(jié)論單鏈抗體A7可以在畢赤酵母中成功地表達，并且可與大鼠肋間肌乙酰膽

2、堿受體結(jié)合. 【關(guān)鍵詞】  單鏈抗體 受體 膽堿能 重癥肌無力    ABSTRACT:OBJECTIVETo determine the specificity of expressed single chain variable fragment (ScFv) A7 of antibody against acetylcholine receptor (AChR) in myasthenia gravis in Pichia pastorisMETHODSThe molecular weight of expressed protein (ScFvA

3、7) was analyzed by sodium dodecyl sulfateolyacrylamide gel electrophoresis (SDSAGE) and Western blotting. The affinity of expressed protein to AChR in mouse intercostals muscles was detected using indirect immunofluorescence technologyRESULTSThe target protein was secreted in the supernatant of expr

4、ession culture medium. Its molecular weight was about 44ku. There was fluorescence between the mouse intercostals muscle cellsCONCLUSIONThe target protein has been expressed from Pichia pastoris GS115 successfully and it can bind to the AChR in mouse intercostals muscles.    Key words:sing

5、le chain variable fragment;receptor, cholinergic;myasthenia gravis    重癥肌無力是抗乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，目前對它的治療主要以非特異性免疫治療為主，此方法雖然可以在一定程度上減輕患者的臨床癥狀，降低死亡率，但可引起廣泛的免疫抑制等嚴重的副作用.特異性免疫治療還處于動物實驗階段，包括口服或經(jīng)鼻黏膜給予乙酰膽堿受體誘導(dǎo)免疫耐受，導(dǎo)入融合FasL基因的抗原提呈細胞以殺傷反應(yīng)性T細胞，而T細胞表位多肽疫苗抑制自身反應(yīng)性T細胞的增殖，單價抗體特異性封閉抗原，以乙酰膽堿受體為配基制備免疫吸附劑，以去除

6、血液中的致病性抗體等13.由致病性抗體制備的單鏈抗體（single chain variable fragment, ScFv）與乙酰膽堿受體的主要免疫原區(qū)結(jié)合后可特異性地封閉致病性抗體的結(jié)合位點，阻止乙酰膽堿受體發(fā)生抗原調(diào)變，同時由于單鏈抗體沒有可結(jié)晶片段（Fc段），無法激活補體，可以起到保護性作用4.由于單鏈抗體分子質(zhì)量更小，易于穿過血管壁進入組織，且易于基因操作，因此對它的研究逐漸被受重視.抗乙酰膽堿受體單克隆抗體A7為高致病性抗體5，由它制備得到的單鏈抗體A7應(yīng)仍然保留著與乙酰膽堿受體較高的結(jié)合活性，并能夠抑制致病性抗體對乙酰膽堿受體的結(jié)合.本實驗的目的是探討單鏈抗體A7在畢赤酵母表達

7、產(chǎn)物的特性，對重癥肌無力的基因治療研究提供實驗依據(jù).    1  材料與方法    1.1  實驗動物及試劑  實驗動物取Wistar大鼠，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科提供.考馬斯亮藍為美國Sigma公司產(chǎn)品，G418、牛血清白蛋白（BSA）及生物素為華美生物工程公司產(chǎn)品，150g/L NextGel蛋白電泳溶液及吐溫20（Tween20）為Amresco公司產(chǎn)品，鼠抗cmyc單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶、異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠抗體、二氨基聯(lián)苯氨（DAB）染色液及P

8、BS為北京鼎國公司產(chǎn)品.    1.2  重組表達載體pPIC9KScFv A7ScFv A7，用Sal酶切質(zhì)粒pPIC9KScFv A7使之線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)斑點雜交試驗檢測證實已有單鏈抗體表達.    1.3  單鏈抗體A7表達產(chǎn)物的一般特性鑒定    1.3.1  含有重組表達載體pPIC9KScFv A7酵母的培養(yǎng)  將攜帶有重組基因表達載體的畢赤酵母GS115復(fù)蘇后，利用抗生素G418篩選高拷貝重組子，用YPD培養(yǎng)基傳

9、代培養(yǎng)，再經(jīng)BMGY，BMMY表達培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，每24h添加純甲醇使甲醇終質(zhì)量濃度為10mL/L誘導(dǎo)表達.在108，120，132h時取樣5mL，以14000r/min離心5min，取上清液經(jīng)低溫濃縮后于4保存?zhèn)溆?    1.3.2  SDSScFv A7蛋白樣品.    1.3.3  蛋白印跡試驗  90V轉(zhuǎn)印2h.移出硝酸纖維素膜，用去離子水沖洗數(shù)次，將洗滌后的硝酸纖維素膜放入盛有100mL PBS20g/L脫脂干奶染缸中，室溫搖動封閉2h，棄掉90mL上述液，加入30mL鼠抗cmyc單

10、克隆抗體，置于4過夜，用PBS20液洗滌3次，再用PBS洗滌2次，每次室溫搖動5min，加入30mL辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，室溫搖動反應(yīng)2h，再用PBS20液洗滌3次，再用PBS洗滌2次，每次室溫搖動5min，加入底物DAB溶液3mL，室溫搖動反應(yīng)30min，倒掉底物溶液，用去離子水沖洗510次，將硝酸纖維素膜取出，用濾紙吸干.陰性對照用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9kScFv A7蛋白樣品.    1.4  單鏈抗體A7表達產(chǎn)物的特異性鑒定  應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù).取體重為200g的Wistar大鼠的肋間

11、肌，行OCT包埋，常規(guī)冰凍切片，在標本處滴加10mmol/L PBS（pH7.4），10min后棄去，滴加40L牛血清白蛋白，室溫下反應(yīng)15min，滴加40L 120h酵母培養(yǎng)濃縮上清液覆蓋標本，室溫下反應(yīng)2h，用10mmol/L PBS（pH7.4）沖洗1,2次，浸洗3次，每次5min，不斷搖動，棄掉上述液并晾干，滴加40L鼠抗cmycScFv A7蛋白樣品.用熒光顯微鏡在藍光下觀察標本，照像.    2  結(jié)果    挑取已經(jīng)整合至酵母GS115的重組載體pPIC9KScFv A7的陽性轉(zhuǎn)化子在甲醇誘導(dǎo)下進行表達，經(jīng)SDS聚丙烯酰

12、胺凝膠電泳及蛋白印跡試驗檢測發(fā)現(xiàn)，含有單鏈抗體A7基因的酵母上清液中出現(xiàn)單鏈抗體A7的表達，在陰性對照酵母培養(yǎng)上清液中無抗體的表達（Fig1）.間接免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示，在大鼠肋間肌細胞膜周圍有綠色熒光出現(xiàn)，而GS115/p PIC9K陰性對照則無熒光出現(xiàn)抗乙酰膽堿受體抗體與神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結(jié)合，可激活補體使突觸后膜乙酰膽堿受體遭到破壞，導(dǎo)致肌肉收縮無力，出現(xiàn)重癥肌無力的癥狀.引起重癥肌無力的病因目前還不清楚，但若給動物免疫乙酰膽堿受體或注射抗乙酰膽堿受體抗體，動物可發(fā)生實驗性自身免疫性重癥肌無力6，7.真核表達載體pPIC9KScFv A7是在重組質(zhì)粒pHEN2ScFv A7

13、8上擴增出單鏈抗體A7基因，并與純化的真核表達載體pPIC9K連接而成，單鏈抗體A7基因末端連接有cmyc標簽基因，這一基因可與單鏈抗體A7基因一起表達.因而，鼠抗cmyc單克隆抗體可以與表達的蛋白結(jié)合，并且羊抗鼠抗體可與鼠抗cmyc單克隆抗體結(jié)合，從而有利于表達產(chǎn)物的鑒定.選擇108，120，132h時的陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清液經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在分子質(zhì)量為44ku處出現(xiàn)了條帶，而陰性對照在相應(yīng)位置上則未見條帶.測定的表達蛋白的分子質(zhì)量與理論值29ku的分子質(zhì)量相比稍大一些，提示有糖基化現(xiàn)象，因為甲醇酵母普遍會對表達蛋白進行糖基化修飾，多為N連接的糖鏈，814個甘露糖加于特征性

14、序列AsnXaaThr/Ser(XaaPro)的Asn上9.采用培養(yǎng)108，120，132h時的陽性轉(zhuǎn)化子的上清液與大鼠肋間肌冰凍切片孵育，使上清液中的表達蛋白充分與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體結(jié)合，再與鼠抗cmyc單克隆抗體結(jié)合后加入羊抗鼠熒光抗體.本實驗結(jié)果表明，在肋間肌細胞膜周圍有綠色熒光出現(xiàn)，而GS115/pPIC9K陰性對照則無熒光出現(xiàn)，提示所分泌的目的蛋白保留了單鏈抗體與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的親和性，這一結(jié)果有重要意義，因為在以后應(yīng)用單鏈抗體治療重癥肌無力中，單鏈抗體必須可與肌肉中固定的乙酰膽堿受體結(jié)合，才能競爭性抑制致病性抗體對乙酰膽堿受體的結(jié)合.本實驗對酵母表達的單鏈抗體A7進行了

15、一般特性和特異性的鑒定，為今后研究單鏈抗體A7治療重癥肌無力研究提供了實驗依據(jù).【參考文獻】  1 Wu JM, Wu B, Miagkov A, et al.Specific immunotherapy of experimental myasthenia gravis in vitro:the “guided missile” strategyJ.Cell Immunol,2001,208(2):137.2 PaasRozner M, Sela M, Mozes E.The nature of the active suppression of responses as

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17、lpJ.FASEB J,2000,14(1):185.4 Park SS, Ryu CJ, Kang YJ, et al.Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigensJ.Mol Immunol,2000,37(18):1123.5 孟繁平，楊康鵑，Graus Y,等.AChR單抗（A7）誘導(dǎo)大鼠的實驗性重癥肌無力的分子基礎(chǔ)J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1996，16（1）：45.6 Meng F, Stassen M, Schillberg S, et al.Construction and characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravisJ.Autoimmunity,2002,35:125.7 De Baets M, Stassen M.The role of