Chapter9蛋白質(zhì)組研究中的翻譯后修飾

1、Proteomics Chapter 9 On Modification After Translation第九章 蛋白質(zhì)組研究中的翻譯后修飾1. 磷酸化蛋白質(zhì)組研究1.1 概況1.1.1 蛋白質(zhì)磷酸化在生命現(xiàn)象的許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制中，蛋白質(zhì)磷酸化是最主要的翻譯后修飾。在1950s發(fā)現(xiàn)磷酸化酶a和磷酸化酶b原來是同一種酶的磷酸化和去磷酸化形式，從那時(shí)開始，人們就開始將蛋白質(zhì)的磷酸化看作是一種動(dòng)態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程，一直受到生物學(xué)家的廣泛重視，重大研究成果層出不窮。在原核生物中，磷酸化位點(diǎn)主要位于組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸殘基，但在真核生物中的磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基上（組氨酸和賴氨酸

2、殘基也可能被磷酸化），傳統(tǒng)的磷酸化分析依賴于放射性同位素標(biāo)記、Edman降解以及薄層層析等方法，這些方法冗長，需要具有高超的實(shí)驗(yàn)技巧和較多的蛋白質(zhì)樣品，并且對(duì)操作者還存在放射性危害。蛋白質(zhì)磷酸化在真核生物中是非常重要而且是非常普遍的現(xiàn)象，據(jù)估計(jì)，在任何一個(gè)給定的時(shí)刻，細(xì)胞內(nèi)有1/3的蛋白質(zhì)存在磷酸化，其中絲氨酸磷酸化最多、蘇氨酸磷酸化次之、酪氨酸磷酸化最少，三者的比例約為1800:200:1。磷酸化對(duì)于蛋白質(zhì)是非均一性的，大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)都有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但這并不意味著某個(gè)蛋白質(zhì)分子的所有潛在的磷酸化位點(diǎn)都是磷酸化的，人類基因組中有2%的序列用來編碼磷酸化蛋白質(zhì)，主要是蛋白質(zhì)激酶和磷酸酯酶

3、，其中絲氨酸和蘇氨酸激酶的數(shù)量是酪氨酸激酶的4倍，其他的磷酸化激酶的數(shù)量基本相同。蛋白質(zhì)可逆磷酸化在調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用，是細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控中心。磷酸化反應(yīng)是泛指把磷酸基團(tuán)通過酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移到其他化合物上的過程。蛋白質(zhì)的磷酸化則是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP 位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的過程，其逆轉(zhuǎn)過程是由蛋白磷酸酶催化的，稱為蛋白質(zhì)的脫磷酸化。蛋白激酶 (Protein kinase, PK)催化蛋白質(zhì)的含羥基氨基酸（絲蘇和酪）的側(cè)鏈羥基形成磷酸酯。蛋白質(zhì)磷酸酯酶 (Protein phosphatase, PPase) 催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而去磷酸化。細(xì)胞

4、內(nèi)任何一種蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的兩種相反酶活性之間的平衡決定的。1.1.2 蛋白質(zhì)磷酸化過程中的質(zhì)量與結(jié)構(gòu)變化要對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化進(jìn)行分析，首先要對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化的化學(xué)有所了解。絲氨酸和蘇氨酸磷酸化是不穩(wěn)定的，在堿性條件下，磷酸基團(tuán)易脫去，發(fā)生消除作用，再脫去一分子水，如下圖所示。絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的不穩(wěn)定性及磷酸基團(tuán)脫落時(shí)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化和質(zhì)量變化 (R=H、CH3)而酪氨酸的磷酸化則由于磷酸基團(tuán)連在苯環(huán)上（如下頁圖所示），不會(huì)發(fā)生消除，相對(duì)是較穩(wěn)定的。磷酸化酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)脫落時(shí)發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化和質(zhì)量變化正是由于酪氨酸無法進(jìn)行消除反應(yīng)，所以絲氨酸、蘇氨酸殘基上的磷

5、酸基團(tuán)脫去后的質(zhì)量變化與酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)脫去后的質(zhì)量變化不同。前者分子量減少98Da，而后者則失去80Da（因?yàn)镠3PO4的分子量為80，而多脫去的水分子量為18）。所以在質(zhì)量變化上，酪氨酸比絲氨酸和蘇氨酸少一步，減少的分子量是80Da，而不是98Da，這些細(xì)節(jié)的質(zhì)量變化是磷酸化質(zhì)譜檢測(cè)中所必需注意的。1.1.3 蛋白質(zhì)磷酸化分析的困難分析蛋白質(zhì)的磷酸化是困難的，盡管現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展非常迅猛，但是磷酸化分析所面臨的難點(diǎn)仍然存在，具體有以下幾點(diǎn)： 磷酸化蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)中是相對(duì)較低豐度的； 即使我們找到一種磷酸化蛋白質(zhì)，也不能排除有該蛋白質(zhì)的其他磷酸化形式存在，在體內(nèi)磷酸化與其像是

6、一座山（靜態(tài)），不如像是一條河（動(dòng)態(tài)）； 細(xì)胞內(nèi)有許多磷酸酯酶，在進(jìn)行樣品處理時(shí)，這些酶很容易將磷酸基團(tuán)脫掉，因而加入磷酸酯酶抑制劑是很必要的； 磷酸化蛋白質(zhì)酶解后的磷酸化肽段，因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)的負(fù)電性，在質(zhì)譜技術(shù)中面臨著難以質(zhì)子化的困難； 磷酸化肽段在質(zhì)譜圖中還往往受到非磷酸化肽段信號(hào)的強(qiáng)烈抑制，這一點(diǎn)在MALDI質(zhì)譜中尤為明顯。1.2 磷酸化蛋白質(zhì)組研究策略蛋白質(zhì)的磷酸化研究是蛋白質(zhì)組學(xué)誕生以來，第一次將一個(gè)整體的研究對(duì)象對(duì)準(zhǔn)一項(xiàng)翻譯后修飾，這樣的選擇是順理成章的。因?yàn)榱姿峄巧顒?dòng)中最重要的一項(xiàng)翻譯后修飾，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長發(fā)育以及癌變機(jī)制等諸多生物學(xué)問題有著密切的關(guān)系，另外，從

7、另一方面來說，磷酸化研究也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)真正意義上的難題，無法回避。如果不能充分理解蛋白質(zhì)的磷酸化現(xiàn)象，就無法認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)在生命中的意義。目前，蛋白質(zhì)的磷酸化研究還未達(dá)到常規(guī)的實(shí)驗(yàn)水平，應(yīng)該說還處于技術(shù)準(zhǔn)備階段，就目前大多數(shù)情況而言，磷酸化蛋白質(zhì)的研究就是磷酸化肽段的研究，由于蛋白質(zhì)磷酸化研究目前還存在上面所講的5個(gè)方面的不足或特點(diǎn)，因而在蛋白質(zhì)的磷酸化研究中，樣品制備就顯得非常重要，除了在進(jìn)行樣品制備時(shí)加磷酸酯酶抑制劑等措施外，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)和肽段的富集是很必要和關(guān)鍵的，除此以外，各種各樣的化學(xué)修飾在磷酸化蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用是很有效果的。因而，要研究蛋白質(zhì)磷酸化，選擇合理有效的化學(xué)策略是

8、必要的，可以預(yù)期，在不久的將來，磷酸化蛋白質(zhì)組研究技術(shù)積累到一定程度后，就會(huì)使用這些方法來研究解決具體的生物學(xué)問題，到那時(shí)，磷酸化蛋白質(zhì)將真正成為一項(xiàng)更大的事業(yè)。磷酸化蛋白質(zhì)組研究的具體策略如下：1.3 磷酸化蛋白質(zhì)的富集策略由于磷酸化蛋白質(zhì)豐度低，而且分析檢測(cè)磷酸化肽段存在困難，使得富集技術(shù)（策略）在磷酸化蛋白質(zhì)組中的研究顯得十分重要、必要。富集的策略應(yīng)用在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中，有兩種不同的應(yīng)用階段，包括富集磷酸化蛋白質(zhì)和富集磷酸化肽段。1.3.1磷酸化蛋白質(zhì)的富集 磷酸化蛋白質(zhì)抗體這是目前富集磷酸化蛋白質(zhì)的主要手段，而磷酸化蛋白質(zhì)的抗體主要分成兩種：一種是絲氨酸磷酸化蛋白質(zhì)和蘇氨酸磷酸化蛋

9、白質(zhì)的抗體，另一種是酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的抗體，其中，酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)抗體的應(yīng)用較早，現(xiàn)已有專一性強(qiáng)、效率高的抗體試劑產(chǎn)品，因此也較早用于免疫共沉淀；最近也已經(jīng)有人使用絲氨酸磷酸化蛋白質(zhì)和蘇氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的抗體，而且這些抗體不但可以用于Western印跡檢測(cè)，還可用于免疫共沉淀純化磷酸化蛋白質(zhì)，這將大大地促進(jìn)免疫共沉淀在磷酸化蛋白質(zhì)富集中的應(yīng)用。 化學(xué)修飾在富集磷酸化蛋白質(zhì)中，也可采用化學(xué)方法進(jìn)行修飾，改變磷酸基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，然后特異性地分離純化，就可以定量地分析這些磷酸化蛋白質(zhì)。但在使用這些方法中，無一例外地要涉及主要的化學(xué)修飾的效率問題，并且在實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的損失也是難免的，這也間接地影響

10、了此類方法的應(yīng)用。 第一種化學(xué)修飾方法該種化學(xué)修飾的基礎(chǔ)是利用磷酸基團(tuán)脫去后的消除反應(yīng)，通過加減反應(yīng)，共價(jià)連接新的化學(xué)修飾基團(tuán)。消除反應(yīng)后生成的脫磷酸氨基酸直接由質(zhì)譜檢測(cè) (MS/MS)，或由EDT (二硫酸乙烷，ethanedithiol) 作為親核試劑，提供一個(gè)新的巰基以便連接一個(gè)生物素的親和標(biāo)簽，為下一步的親和純化和同位素的標(biāo)記定量 (ICAT) 提供條件。肽段中的半胱氨酸和甲硫氨酸會(huì)和EDT產(chǎn)生副反應(yīng)，因此首先要對(duì)這兩種殘基進(jìn)行強(qiáng)烈氧化，使其喪失活性。這種化學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)是：所有的反應(yīng)都在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，沒有很多的反應(yīng)步驟，反應(yīng)的產(chǎn)率有一定的保證。但這種方法也有明顯的缺點(diǎn)：就是對(duì)酪

11、氨酸的磷酸化無能為力。 第二種化學(xué)修飾方法是對(duì)第一種方法的合理補(bǔ)充，它可以應(yīng)用于對(duì)酪氨酸磷酸化的修飾。這種方法在保護(hù)肽段的氨基和羧基端的基礎(chǔ)上，對(duì)磷酸基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，然后用具特異性化學(xué)表面的微球進(jìn)行純化。很明顯，這種方法的化學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜，其核心是對(duì)磷酸基團(tuán)的修飾，以便使有特異性化學(xué)表面的玻璃珠結(jié)合純化。該方法的缺點(diǎn)：步驟太多、產(chǎn)率相對(duì)較低。1.3.2 磷酸化肽段的富集策略(1) 固定金屬螯合親和層析在磷酸化蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用的抗體只是對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)有效，對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行富集使用較多是固定金屬螯合親和層析(immobilized metal affinity chromatography, IM

12、AC)法。IMAC技術(shù)最初用于純化含組氨酸的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在常被用于選擇性地富集磷酸化肽段，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的富集無效。IMAC柱填料的基本構(gòu)成是色譜填料-交聯(lián)劑-金屬螯合劑。色譜填料與金屬螯合劑亞氨基二乙酸或次氮基三醋酸交聯(lián)成為固定相，常用的金屬離子為Fe3+、Ga3+或Cu2+等，被螯合到固定相上。磷酸基團(tuán)與固相化的金屬離子通過靜電作用吸附，可選擇性地親和提取磷酸化肽段，在堿性環(huán)境下或有磷酸鹽存在時(shí)，這種相互作用被破壞從而使磷酸化肽段被洗脫。據(jù)報(bào)道Ga3+的富集效果要好于Fe3+，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)e3+的效果是也可接受的，而且由于Fe3+價(jià)格便宜和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，因而，F(xiàn)e3+比Ga3+的應(yīng)

13、用更廣泛些。IMAC技術(shù)對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化都有效，但是IMAC柱上的正電荷位點(diǎn)同樣可與肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸殘基結(jié)合，從而對(duì)特異性和非特異性肽段同時(shí)富集，所以IMAC方法面臨的最主要的缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，如果對(duì)磷酸化肽段中的酸性殘基預(yù)先進(jìn)行甲基酯化，封閉上述氨基酸的酸性側(cè)鏈，從而可大大提高IMAC方法的特異性，這一方法彌補(bǔ)了IMAC技術(shù)的最大缺陷，為大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究展現(xiàn)了美好的前景。(2) 磷酸基團(tuán)親和取代將磷酸化肽段上的磷酸基團(tuán)用另一種親和基團(tuán)取代，再用親和提取的方法從混合物中分離富集磷酸肽，是近幾年出現(xiàn)的一種新技術(shù)。主要有兩種取代方式：一種是使

14、磷酸基團(tuán)在堿性條件下發(fā)生-消除反應(yīng)生成雙鍵，再用巰基乙醇通過加成反應(yīng)取代磷酸基團(tuán)的位置，最后通過交聯(lián)劑在巰基上連接生物素，并用親和素色譜柱分離，這種方法只適合于磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的取代；另一種是通過化學(xué)反應(yīng)在磷酸基團(tuán)上連接一個(gè)半胱胺基團(tuán)(cysteamine)，修飾后的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝膠親和提取，這種方法適合對(duì)各種磷酸化氨基酸的取代。這兩種磷酸基團(tuán)的親和取代方法都需要進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，為了避免副反應(yīng)的影響，都需要對(duì)蛋白質(zhì)中的一些活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，整個(gè)反應(yīng)體系比較復(fù)雜。1.3.3 磷酸化蛋白質(zhì)/肽段富集策略的優(yōu)缺點(diǎn)以抗體為基礎(chǔ)的對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的富集策略有效但很昂貴，現(xiàn)階段酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)

15、的抗體比絲氨酸、蘇氨酸的要有效些，對(duì)于大多數(shù)國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室而言，也是同樣有效的，但受財(cái)力所限使用困難；而以色譜方法為基礎(chǔ)的對(duì)磷酸化肽段的富集策略(IMAC)，同樣是有效的，甚至于在有化學(xué)修飾輔助下更加有效，而重要的是試驗(yàn)花費(fèi)與前者相比微不足道，因而會(huì)有更好的應(yīng)用前景。1.4 磷酸化肽段的質(zhì)譜檢測(cè)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，一是離子源，二是檢測(cè)器。就離子源而言，自1980s發(fā)明了ESI、MALDI之后，就少有新的技術(shù)出現(xiàn)，至今生物質(zhì)譜技術(shù)中的離子化方式就是這兩種；而就檢測(cè)器而言，種類較多，有經(jīng)典的三級(jí)四級(jí)桿、離子阱和飛行時(shí)間檢測(cè)器，也有稍后發(fā)展的Qq-TOF、TOF-TOF、FTICR。近年來，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展主

16、要集中在離子源和檢測(cè)器、檢測(cè)器和檢測(cè)器的“雜交”上，研發(fā)出了多種新款質(zhì)譜應(yīng)用于生物學(xué)研發(fā)中的各個(gè)領(lǐng)域，現(xiàn)就從生物質(zhì)譜技術(shù)的特征出發(fā)，介紹其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用。1.4.1以MALDI 為離子源以MALDI為離子源的生物質(zhì)譜通過PMF (peptide mass pingerprint) 技術(shù)，在鑒定蛋白質(zhì)的工作中取得了良好的結(jié)果，但將MALDI離子源的質(zhì)譜應(yīng)用于蛋白質(zhì)組磷酸化研究遇到了難題。這是因?yàn)椋毫姿峄亩问菐ж?fù)電性的，而生物質(zhì)譜常常用正離子模式，因而它的離子化就顯得不夠，更糟糕的是在進(jìn)行磷酸化研究時(shí)，磷酸化肽段常常和非磷酸化的肽段混合在一起，在MALDI源的情況下，磷酸化肽段的質(zhì)譜信號(hào)

17、會(huì)被非磷酸化肽段的質(zhì)譜信號(hào)抑制；在未富集的情況下，一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)的磷酸化肽段在MALDI時(shí)，經(jīng)常會(huì)淹沒在其他非磷酸化肽段的信號(hào)中，連信號(hào)都沒有，更甭說研究磷酸化的位置、數(shù)量和變化；此外，因?yàn)橐訫ADLI為離子源的質(zhì)譜靶點(diǎn)上的樣品幾乎同時(shí)離子化，所以蛋白質(zhì)必須先進(jìn)行分離純化。目前在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，應(yīng)用最廣的分離純化方法還是雙向電泳和HPLC。因而MADLI質(zhì)譜分析磷酸化時(shí)，就會(huì)需要一些必要的前處理。 磷酸酯酶被應(yīng)用于磷酸化肽段的檢測(cè)中磷酸酯酶處理蛋白質(zhì)的前后，磷酸化肽段的質(zhì)量數(shù)有變化，這為磷酸化肽段的檢測(cè)提供了前提條件，更主要的是，很多磷酸化肽段在脫去磷酸基團(tuán)后，質(zhì)譜信號(hào)會(huì)有很大的提高。這樣

18、比較前后圖譜，尋找質(zhì)量數(shù)變化80 Da或98 Da和強(qiáng)度增大的信號(hào)就很可能是磷酸化肽段。在磷酸酯酶反應(yīng)時(shí)，絲氨酸和蘇氨酸磷酸化肽段的質(zhì)量變化可能是80 Da，也可能是98 Da，后者的發(fā)生是因?yàn)樵诹姿峄鶊F(tuán)脫落后發(fā)生了消除反應(yīng)，酪氨酸磷酸化肽段只有80 Da 的質(zhì)量數(shù)變化。磷酸酯酶的另一種應(yīng)用方式就是固定化磷酸酯酶，使脫磷酸的作用發(fā)生在親和柱上，這就提高了酶反應(yīng)的效率和該方法的自動(dòng)化程度。 磷酸化肽段的富集以MADLI為離子源的質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化肽段時(shí)，對(duì)磷酸化肽段的富集顯得更為重要，其中，IMAC技術(shù)與之結(jié)合使用較為多見。磷酸化肽段經(jīng)過富集，在MALDI質(zhì)譜上的檢測(cè)信號(hào)會(huì)有較大的提高，對(duì)于這一點(diǎn)，

19、如果能對(duì)酪蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行IMAC富集，其磷酸化肽段的信號(hào)將得到明顯的增強(qiáng)。1.4.2 以ESI為離子源ESI-MS在磷酸化肽段的檢測(cè)中，有著比MADLI-MS更廣泛的應(yīng)用和更好的前景。在大多數(shù)情況下，ESI-MS都會(huì)與HPLC連用，這使其可以分析較為復(fù)雜的系統(tǒng)，而不像許多MADLI-MS只能分析相對(duì)較純的樣品或者是不太復(fù)雜的肽段混合物。近年來，MS技術(shù)與毛細(xì)管HPLC 結(jié)合，而且越來越多的實(shí)驗(yàn)室開始使用nano-spray的ESI技術(shù)，大大提高了ESI 技術(shù)的靈敏度和應(yīng)用的范圍；同時(shí)，也是由于ESI與色譜技術(shù)的良好兼容性，多種現(xiàn)代色譜技術(shù)參與其中，與ESI-MS連用，從而也大大推動(dòng)了質(zhì)譜技

20、術(shù)的發(fā)展，如多維色譜技術(shù)、IMAC技術(shù)、微柱HPLC以及填料技術(shù)等都越來越多地在質(zhì)譜技術(shù)中發(fā)揮作用?？梢哉f，ESI-MS是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主力，同時(shí)也是磷酸化蛋白質(zhì)組研究中的重要武器。 前離子掃描 / 母離子掃描(precursor / parent ion scan)前體檢測(cè)的思路是：利用磷酸基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，檢測(cè)它在各種條件下生成的有特點(diǎn)的離子，這其中有帶負(fù)電荷的-PO43-，也有帶正電荷的亞氨離子 (immoniumion: 1995年, Hoffman R首先描述了immonium ion是酪氨酸磷酸化肽段的特征性的碎片離子）。該方法的離子源都是電噴霧的，而質(zhì)量分析器主要是串聯(lián)質(zhì)譜，如三

21、級(jí)四級(jí)阱、Qq-TOF等。在三級(jí)四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中，連續(xù)掃描第一個(gè)分析器Q1，使各種質(zhì)荷比的離子依次通過Q1，Q2為碰撞室，將Q3分析器設(shè)定為只能傳輸某一特定質(zhì)荷比的子離子，如m/z為79 (PO3-)的離子，這樣得到的質(zhì)譜圖僅顯示會(huì)產(chǎn)生m/z為79的譜峰。由于多肽產(chǎn)生的各種碎片離子幾乎沒有質(zhì)量數(shù)在79 Da附近的，所以用這一質(zhì)量數(shù)進(jìn)行磷酸化肽段母離子掃描的特異性很高，但必須在負(fù)離子檢測(cè)模式下分析，進(jìn)行序列分析較困難。Annan等以這種掃描方式為基礎(chǔ)建立了一套分析磷酸化肽段的系統(tǒng)方法，肽混合物先經(jīng)LC-MS分析，在負(fù)離子檢測(cè)模式下經(jīng)母離子掃描找出含有磷酸化肽段的液相餾份，收集該餾份再次用母離子

22、掃描方式確定磷酸化肽段，最后在正離子模式下對(duì)該磷酸化肽段進(jìn)行序列分析。該方法后來又優(yōu)化為采用毛細(xì)管液相色譜和微量餾份收集裝置，靈敏度有了很大提高。如果能在正離子模式下進(jìn)行磷酸肽的母離子掃描，則分析步驟會(huì)簡化很多，這需要磷酸肽能夠產(chǎn)生合適的特征離子。如酪氨酸磷酸肽能產(chǎn)生m/z為216.043的特征離子，這是磷酸酪氨酸的亞氨離子，選擇該離子進(jìn)行母離子掃描，可以在正離子檢測(cè)模式下選擇性檢測(cè)酪氨酸磷酸肽。但是由于各種氨基酸殘基產(chǎn)生的質(zhì)量數(shù)在216.043附近的碎片離子也有不少，而四極桿質(zhì)量分析器的分辨率較低、選擇性會(huì)較差，飛行時(shí)間質(zhì)量分析器又不是掃描型分析器，所以Q-TOF型質(zhì)譜儀不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的

23、母離子掃描。解決這一問題的主要設(shè)計(jì)方案是Q2 pulsing策略，就是使子離子在進(jìn)入TOF分析器之前先被一個(gè)脈沖電場俘獲(trap)很短的一段時(shí)間，離子的釋放與TOF分析器正交加速電場的脈沖電壓同步，這樣可以使小分子碎片離子的傳輸率提高到95%以上。在具有Q2 pulsing功能的儀器上（如AB Qstar）可以成功地進(jìn)行母離子掃描分析。Steen等對(duì)三級(jí)四極質(zhì)譜儀與Qq pulsing-TOF質(zhì)譜儀的母離子掃描功能進(jìn)行了比較，結(jié)果表明二者均可在負(fù)離子模式下進(jìn)行m/z為79的母離子掃描。而在正離子模式下對(duì)m/z為216.043的母離子掃描只適用于Qq pulsing-TOF質(zhì)譜儀。他們還用m/

24、z為216.043母離子掃描方法結(jié)合免疫沉淀技術(shù)對(duì)EGF受體信號(hào)通路中的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定和磷酸化位點(diǎn)分析。為了使絲氨酸和蘇氨酸也可以在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描實(shí)驗(yàn)，Steen等基于磷酸化氨基酸的-消除反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種化學(xué)修飾方式，使這兩種磷酸化氨基酸在正離子檢測(cè)模式下可以產(chǎn)生特征的碎片離子用于母離子掃描實(shí)驗(yàn)。正離子模式下母離子掃描的最大優(yōu)點(diǎn)是可以直接對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行序列和磷酸化位點(diǎn)分析。 中性丟失掃描(neutral loss scan)在三級(jí)四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀中，使第一個(gè)質(zhì)量分析器 (Q1) 和第三個(gè) (Q3) 質(zhì)量分析器同步掃描，但掃描范圍保持一個(gè)特定的電壓差值，這個(gè)電壓差所代表

25、的m/z值為中性磷酸分子的質(zhì)量(m/z 97.9或m/z 49)。Q1輸送過來的離子在Q2內(nèi)裂解后進(jìn)入Q3，只有在Q2中能裂解產(chǎn)生磷酸分子的離子才會(huì)被Q3傳輸?shù)綑z測(cè)器。此法的優(yōu)點(diǎn)是以正離子模式進(jìn)行掃描分析，找到磷酸化肽段后可以直接分析序列及磷酸化位點(diǎn)，但是它的特異性不高，比較容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要從串聯(lián)譜圖中加以確認(rèn)。1994年，Hunter等最早闡述了磷酸化肽段在CID前后的質(zhì)量數(shù)變化，在大多數(shù)情況下，磷酸化肽段的質(zhì)量數(shù)變化是98 Da，以這一特異性的質(zhì)量變化為判斷磷酸化是否存在的依據(jù)。中性丟失掃描在磷酸化質(zhì)譜檢測(cè)的方法中占有主要的地位，該方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于思路比較簡潔，可以完全在正離子模

26、式下操作，不會(huì)像前離子掃描那樣碰到負(fù)離子模式下的靈敏度下降的問題。此外，此方法在離子阱分析器中也有很好的應(yīng)用。從理論上講，在MS的正離子模式下，使用中性丟失掃描是檢測(cè)磷酸化肽段的好方法。在方法學(xué)的層面上，就有學(xué)者研究后認(rèn)為是有效的。但是，在面對(duì)未知蛋白質(zhì)樣品時(shí)，就顯得很困難，其原因是多方面的，但最大的困難是磷酸化肽段混合物在沒有富集的情況下，磷酸化肽段的信號(hào)和非磷酸化肽段的信號(hào)相比是較弱的，如果母離子的信號(hào)很弱，選擇作CID 時(shí)就會(huì)相當(dāng)困難，這一點(diǎn)無論是手工選擇還是程序選擇都一樣會(huì)很困難。當(dāng)然如果采用更有效的富集手段，或者離子化前的分離效果很好（比如使用多維色譜分離肽段混合物），還是會(huì)有良好的

27、效果的。此外，中性丟失掃描的困難還在于，當(dāng)磷酸化肽段太大 (>2000 Da) 時(shí)，在作中性丟失掃描時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)信號(hào)的信噪比不好，這是因?yàn)橄鄬?duì)分子質(zhì)量較大的肽段本身的信號(hào)就不好，更何況還有磷酸化。針對(duì)此困難，有人提出用低特異性的蛋白酶（如彈性蛋白酶elastase）酶解磷酸化蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小分子的肽段來解決這一問題，肽段碎片序列的信息在一定程度上可以彌補(bǔ)低特異性蛋白酶造成的數(shù)據(jù)處理困難。1.5 磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜分析磷酸化位點(diǎn)分析是肽段磷酸化分析中的難點(diǎn)。1.5.1 CID碎片分析CID：collion induceddissociation 碰撞誘導(dǎo)解離（分裂）一般在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中要獲得

28、氨基酸的序列信息，所依賴的是在質(zhì)譜中獲得相關(guān)肽段的碎片信息，然后用一些算法（如SEQUEST等）將碎片離子的質(zhì)譜圖譜與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)打分，獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以確定肽段的序列。而那些碎片離子的獲得，主要是采用CID獲得的，CID技術(shù)是引入惰性氣體將肽段離子撞碎，也即是引入的是能量，是能級(jí)的升高迫使肽鍵斷裂，磷酸基團(tuán)的酯鍵的鍵能比肽鍵的要低，因此，在CID時(shí)，磷酸酯鍵比肽鍵更容易斷裂，這一點(diǎn)直接造成了磷酸化位點(diǎn)判斷的困難。有學(xué)者報(bào)道，在肽鍵的氨基末端進(jìn)行化學(xué)修飾，會(huì)使較多的磷酸基團(tuán)保留在肽段碎片中，使磷酸化位點(diǎn)分析更為簡單。因此，通過化學(xué)修飾，使磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化成相對(duì)穩(wěn)定的基團(tuán)，在進(jìn)行低能量的CID時(shí)，盡

29、可能保留磷酸化位點(diǎn)（盡管此時(shí)已經(jīng)不是磷酸基團(tuán)），可以對(duì)磷酸化位點(diǎn)信息進(jìn)行解析。1.5.2 ECD碎片分析ECD: electron capture dissociation 電子俘獲分裂FTICR（傅立葉離子回旋共振）是一種相對(duì)較新的用于生物合成的質(zhì)譜，具有相當(dāng)高的分辨率和精確性，是幾乎現(xiàn)有生物質(zhì)譜中功能最強(qiáng)大的一種。對(duì)于磷酸化肽段的分析，F(xiàn)TICR也有非常重要的作用，其原因就是FTICR的碎片模式是所謂的電子俘獲分裂技術(shù)。該技術(shù)的原理是：照射一束亞熱態(tài) (subthermal) 的電子到電噴霧所產(chǎn)生的磷酸化肽段或者是小分子的蛋白質(zhì)分子本身，使其形成碎片。與CID撞擊肽段時(shí)產(chǎn)生的大量b和y族碎

30、片不同，ECD技術(shù)產(chǎn)生的多是c和z離子碎片，更為重要的是，磷酸基團(tuán)在ECD中保留在碎片分子中，使得直接判斷磷酸化位點(diǎn)成為一種可能。FTICR的分辨率極高，是其他生物質(zhì)譜的10倍左右，正因?yàn)榇?，它甚至還可對(duì)小分子蛋白質(zhì)不經(jīng)酶解而直接分析磷酸化狀態(tài)。1.6 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的定量問題這是難點(diǎn)中的難點(diǎn)，無論是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的那個(gè)分支都要遇到。主要方法：同位素標(biāo)記在磷酸化定量中的應(yīng)用，該方法有2種類型。1.6.1 穩(wěn)定性同位素標(biāo)記磷酸化研究的同位素標(biāo)記策略是：在細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入穩(wěn)定性同位素（主要是15N），與在普通培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞進(jìn)行比較而得到定量的結(jié)果。這種實(shí)驗(yàn)方法的具體操作是將在兩種不同培

31、養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞等量混合，裂解細(xì)胞后分離所感興趣的蛋白質(zhì)，經(jīng)酶解并由質(zhì)譜檢測(cè)分析。選定的蛋白質(zhì)的非磷酸化肽段的同位素比例是相對(duì)固定的（并不是一定相等，而是比例大致不變），而同時(shí)磷酸化肽段及其非磷酸化部分的比例并不會(huì)發(fā)生變化，這種變化應(yīng)該是向相反方向發(fā)展的。這種試驗(yàn)方法的設(shè)計(jì)非常巧妙，讓人發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生的“化學(xué)反應(yīng)”式的效果，這種方法將蛋白質(zhì)的鑒定與磷酸化的定量同時(shí)完成，而且還可以了解磷酸化的程度，一舉多得。但這種思路也有其缺陷： 15N同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基的獲得有一定的困難； 這種方法只能應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞，對(duì)其他生物樣本有困難，標(biāo)記的效率和均一性也是一個(gè)問題； 質(zhì)譜分析前需

32、要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，而低豐度蛋白質(zhì)能否實(shí)現(xiàn)有效分離，值得懷疑，以及分離酶解后是否能找到感興趣的磷酸化肽段也并非完全由實(shí)驗(yàn)者的意愿決定。1.6.2 同位素標(biāo)記的親和試劑同位素標(biāo)記的親和試劑與磷酸化肽段在磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，從而給磷酸化肽段加上親和尾部，引入質(zhì)量數(shù)的差異，以便在質(zhì)譜分析時(shí)根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行定量。該方法的思路實(shí)際上來自ICAT，因此被稱為PhIAT (phosphoprotein isotope-coded affinity tag)，只是肽段上的磷酸基團(tuán)參加反應(yīng)而不是巰基。這種定量思路比前者要直接一些，更重要的是，要想合成實(shí)驗(yàn)所用的PhIAT試劑，這對(duì)于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是有難度的，而購買商

33、品化的試劑又比較昂貴。但是從ICAT方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中的一般定量的應(yīng)用來看，PhICAT應(yīng)該有良好的前景。1.7 蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)力學(xué)研究蛋白質(zhì)磷酸化的過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，因此可以說靜態(tài)的磷酸化定量研究是不完善的，磷酸化的研究在技術(shù)條件允許的情況下，總是要進(jìn)行動(dòng)態(tài)、定量研究的。現(xiàn)在，對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化的動(dòng)力學(xué)研究才剛剛開始，技術(shù)上還處于初級(jí)階段，不過已有人在探索。Ruse等人用液質(zhì)聯(lián)用，計(jì)算的是色譜面積，在有標(biāo)準(zhǔn)肽段進(jìn)行校正的情況下，對(duì)體外的磷酸化反應(yīng)，進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，不過其工作僅限于標(biāo)準(zhǔn)的，總的來說，磷酸化的動(dòng)力學(xué)研究還有待開拓。2糖基化蛋白質(zhì)組研究2.1 糖基化蛋白質(zhì)的研究概況2.1.1

34、問題的提出及發(fā)展1988年，牛津大學(xué)的生物化學(xué)學(xué)家Raymond Dwek在“Annual Review of Biochemistry（生物化學(xué)年評(píng)）”雜志上發(fā)表了題為“Glycobiology（糖生物學(xué)）”的綜述文章，標(biāo)志著糖生物學(xué)這一新的研究領(lǐng)域的誕生。近些年來，隨著不同物種基因組計(jì)劃的陸續(xù)完成，以及蛋白質(zhì)組研究的開展和各種分離鑒定技術(shù)的進(jìn)步，推動(dòng)了糖生物學(xué)的迅速發(fā)展。如美國新罕布什大學(xué) (UNH) 化學(xué)系的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中心啟動(dòng)了一次“線蟲糖組學(xué)研究”計(jì)劃，分析測(cè)定線蟲的糖組（glycome, 定義為細(xì)胞內(nèi)所有的糖鏈組分），開展糖組學(xué) (glycomics) 研究，目的在于確定基因所攜

35、帶的遺傳信息與其功能之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要的加工過程，它是指蛋白質(zhì)與葡萄糖（醛基糖）之間發(fā)生的非酶反應(yīng)而生成糖化蛋白的過程，即指在肽鏈生物合成的同時(shí)或合成后在酶的催化下糖鏈被接到肽鏈上的特定糖基化位點(diǎn)的過程。人類基因組計(jì)劃完成后，美國于2001年9月正式啟動(dòng)了“功能糖組學(xué)”研究項(xiàng)目，項(xiàng)目的總體目標(biāo)是闡明由蛋白質(zhì)-糖鏈相互作用所介導(dǎo)的細(xì)胞通訊機(jī)制?；蚪M計(jì)劃提供了最基本的遺傳信息，而許多基因的功能仍需要闡明，其中的關(guān)鍵就是要了解蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，而蛋白質(zhì)糖基化便是最主要的翻譯后修飾之一。盡管糖組的定義與基因組及蛋白質(zhì)組類似，但其研究應(yīng)該主要集中在蛋白質(zhì)糖基化上，而蛋白

36、質(zhì)糖基化研究的基本目標(biāo)是： 尋找編碼糖蛋白的基因，即基因組信號(hào)； 尋找糖基化位點(diǎn)，即糖基化位點(diǎn)信息； 解析糖鏈及糖基化肽段的結(jié)構(gòu)，即結(jié)構(gòu)信息； 研究糖基化的功能，即功能信息。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，應(yīng)當(dāng)更好地將蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和研究策略應(yīng)用到大規(guī)模的蛋白質(zhì)糖基化研究中。2.1.2 糖基化蛋白質(zhì)研究的必要性 生物信息流現(xiàn)代分子生物學(xué)中心法則認(rèn)為，生物信息的流向是從“DNARNAProtein”，如上圖紅虛框中所示。而實(shí)際上，糖類和脂類也是組成生物體所需的兩類主要分子，其生物信息流應(yīng)補(bǔ)充如上圖所示。因而，應(yīng)從基因組水平上來關(guān)注蛋白質(zhì)的糖基化，在真核生物的細(xì)胞中，有一半以上的蛋白質(zhì)被糖基化，因此非常有必要

37、對(duì)蛋白質(zhì)糖基化進(jìn)行研究。這是因?yàn)椋?蛋白質(zhì)糖基化存在于細(xì)胞生命活動(dòng)的各個(gè)方面所有的細(xì)胞表面都由很多不同類型的糖鏈所包被，并且在細(xì)胞內(nèi)也存在各種類型的糖基化；蛋白質(zhì)糖基化在蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)定位和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)溶解性、抗原性以及細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用等方面都有著重要的作用。最近還發(fā)現(xiàn)構(gòu)成細(xì)胞膜的許多脂肪或蛋白質(zhì)是以糖脂或糖蛋白的形式存在，而且糖低聚物在細(xì)胞間信號(hào)傳遞中也存在主要作用。 糖基化蛋白質(zhì)在病理中的作用由于糖在HIV或其他致病源與血細(xì)胞結(jié)合過程中扮演重要的角色，它成為免疫與控制和治療癌癥的最主要的線索之一。 多樣性具有足夠多的多樣性是作為任何信息分子的基礎(chǔ)，而糖鏈比核酸和蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上更具有

38、可變性。如由六個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸，可能的序列僅有464096種；由六個(gè)氨基酸組成的多肽，可能的序列有2066.4×107；由六個(gè)單糖組成的寡糖鏈，可能的序列則多達(dá)1.05×1012。聚糖極高的復(fù)雜性明顯地歸因于“連接方式異構(gòu)體”和“分枝形成”，而這種現(xiàn)象在其他的生物信息分子中并不存在。由于糖鏈結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其可能包含的信息量比核酸和蛋白質(zhì)多幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 在分子進(jìn)化中的作用聚糖中許多令人感興趣的方面可能反映了生物與它們的分子的進(jìn)化作用。如多糖中少數(shù)穩(wěn)定構(gòu)成單位的自然選擇；甲醛聚糖反應(yīng)(formose)可能是前生物期合成糖類的反應(yīng)，而糖酵解逆反應(yīng)中的醇醛縮合并生成果糖的過程

39、又和甲醛聚糖反應(yīng)的最后一步相同；Lotry-de-Bruyn重排反映了果糖、葡萄糖及甘露糖之間的親緣關(guān)系；復(fù)雜的單糖如唾液酸和脫氧己糖可由葡萄糖或甘露糖產(chǎn)生，反映了生物合成的保守性；乳糖的出現(xiàn)可能是在分子進(jìn)化過程的后期；核糖和核酸的起源仍是一個(gè)未解的迷題；。2.1.3 糖基化蛋白質(zhì)的類別在真核細(xì)胞中，寡糖鏈與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸以多種形式共價(jià)連接，構(gòu)成糖蛋白的糖肽連接鏈，簡稱糖肽鏈。根據(jù)糖肽鏈的類型，蛋白質(zhì)糖基化可以分為四類：即以絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸和羥脯氨酸的羥基為連接點(diǎn)，形成-O-糖苷鍵型的O-連接糖蛋白；以天冬酰胺的酰胺基、N-末端氨基酸的-氨基以及賴氨酸或精氨酸的-氨基為連接點(diǎn)，

40、形成-N-糖苷鍵型的N-連接糖蛋白；以半胱氨酸為連接點(diǎn)的氨基葡萄糖多聚糖糖蛋白；以天冬氨酸或谷氨酸的游離羧基為連接點(diǎn)，形成酯糖苷鍵型的磷脂酰肌醇糖蛋白。 N-連接糖基化蛋白質(zhì)N-糖基化通常是指糖鏈共價(jià)連接在蛋白質(zhì)肽鏈上的天冬酰胺 (Asn) 殘基的酰胺基、N-末端氨基酸殘基的-氨基、賴氨酸或精氨酸殘基的-氨基處。糖鏈與天冬酰胺殘基的連接發(fā)生在三個(gè)殘基的特殊識(shí)別序列 (Asn-X-Ser/Thr，其中的X為除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸）處。N-糖鏈通?？蓜澐譃槿N類型：甘露糖型、復(fù)雜型和混合型。所有的N-糖鏈都有一個(gè)相同的五糖核心，其結(jié)構(gòu)式與分子式分別為Man1-3(Man1-6)Man1

41、-4GlcNAc1-4GlcNAc、GlcNAc2Man3，如下圖所示。 N-連接葡萄糖胺的五糖核心結(jié)構(gòu)其中： 高甘露糖型可在這個(gè)五糖核心上再連接29個(gè)甘露糖(Man)； 復(fù)雜糖型則有更多的N-乙酰葡萄糖胺(N-GlcNAc)、半乳糖(galactose)、唾液酸(sialic acid)、巖藻糖(fucose)及木糖(xylose)與五糖核心相連，其中唾液酸提供了額外的負(fù)電荷。 混合型的糖鏈結(jié)構(gòu)則兼具以上兩種糖鏈結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。 O-糖基化蛋白質(zhì)通常是指糖鏈通過N-乙酰葡萄糖胺連接在蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸或羥脯氨酸殘基側(cè)鏈的羥基處。也有其他類型的連接，如通過O-甘露糖。其中，多細(xì)胞的真

42、核生物中存在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸殘基的動(dòng)態(tài)糖基化 (O-連接的N-乙酰葡萄糖胺即O-GlcNAc)。在一些蛋白質(zhì)中，O-GlcNAc糖基化與O-磷酸化發(fā)生在相同或相近的位點(diǎn)上，從而出現(xiàn)一種假說，認(rèn)為O-GlcNAc可暫時(shí)阻斷O-磷酸化。蛋白質(zhì)的O-GlcNAc在生理、病理以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中都具有重要的作用。 糖基磷脂酰肌醇錨 (GPI-Achor) 糖基化蛋白質(zhì)通常是指蛋白質(zhì)通過天冬氨酸或谷氨酸殘基的游離羧基的C端共價(jià)連接的糖基磷脂酰肌醇錨定在膜脂上，這將細(xì)胞外蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜連接。通過GPI連接到細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)與穿越細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)不同，因?yàn)樗麄兛梢员籔I-PLC（磷酸肽肌糖特

43、異性磷酯酶C）分離到細(xì)胞外的空間。在真核細(xì)胞中，很多胞外蛋白質(zhì)（包括一些水解酶、細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞黏著蛋白等）都通過糖基磷脂酰肌醇錨結(jié)合在質(zhì)膜上。 以半胱氨酸殘基為連接點(diǎn)的氨基葡萄糖多聚糖糖蛋白2.2 研究蛋白質(zhì)糖基化的常用方法與核酸和蛋白質(zhì)不同，糖鏈很少以線性、非分枝方式出現(xiàn)，而是存在許多可變的修飾。因此，對(duì)糖鏈完整序列的測(cè)定很難通過一種方法來完成，而是需要物理的和化學(xué)的方法反復(fù)組合，最終確定糖鏈詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息（如質(zhì)譜和核磁共振的方法）。糖蛋白的分析流程如下：研究蛋白質(zhì)糖基化的工具和方法包括酶（內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶）、凝集素（糖結(jié)合蛋白）、化學(xué)的修飾及斷裂、新陳代謝放射性標(biāo)記、糖基化抑止劑

44、、抗體、糖基化轉(zhuǎn)移酶的分子克隆以及在生物體及細(xì)胞中的遺傳操作等。2.3 糖基化蛋白質(zhì)的分離技術(shù)從“基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)”的整體觀念出發(fā)，應(yīng)以基因組信息為基礎(chǔ)，以研究糖蛋白為中心。糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究糖肽比研究單純的聚糖更合適，其首要任務(wù)是從蛋白質(zhì)混合物中分離純化糖蛋白，再采用“糖捕獲”法從糖蛋白中分離純化糖肽，然后再分別對(duì)肽鏈和糖鏈進(jìn)行分析。其中：多種凝集素可被用來分離帶有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白和糖肽，如半乳糖苷結(jié)合凝集素 (galectin) 可分離包含N-乙酰乳糖胺 (LacNAc) 的N-連接的和O-連接的糖鏈；伴刀豆凝集素A (ConA) 可分離N-連接的糖鏈；花生凝集素 (PN

45、A) 可分離包含T抗原 (Gal1-3GalNAc結(jié)構(gòu)) 的O-連接的糖鏈；橙黃網(wǎng)孢盤菌 (Aleuria aurantin, 一種蘑菇）凝集素 (AAL) 對(duì)含有L-巖藻糖的糖鏈具有廣泛的特異性；等等。如何選擇這些凝集素在“糖捕獲”法中是最為關(guān)鍵的步驟。 因而，非常有必要了解一些具有代表性的凝集素的典型特征，如親和性、特異性、熱穩(wěn)定性、是否需要金屬離子和多共價(jià)鍵的情況等。伴刀豆凝集素A (ConA) 和galectin LEC-6 (Gal6) 可特異性地結(jié)合到高甘露糖型或復(fù)雜型的N-連接的糖鏈上；而花生凝集素 (PNA) 則對(duì)存在于O-連接的糖鏈的T抗原 (Gal13GalNAc結(jié)構(gòu)）具有

46、很高的親和性。伴刀豆凝集素 (ConA)、galectin LEC-6 (Gal6)、PNA是常用的三類凝集素，分述如下： ConAConA是一種典型的對(duì)于一系列高甘露糖型的N-連接的糖鏈有高親和性的植物凝集素。ConA同時(shí)也能結(jié)合復(fù)雜型的N-連接的糖鏈及雙分枝的復(fù)雜型的N-連接的糖鏈。 galectin LEC-6 (Gal6)galectin是一類分布廣泛、依賴于金屬離子的可溶性lectin，其對(duì)于-半乳糖苷的特異性在很多多細(xì)胞生物中具有保守性。到目前為止，在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了幾種galectin并被命名為galectin-1到galectin-6，根據(jù)結(jié)構(gòu)，可分為三類：原型、嵌和型和串聯(lián)

47、重復(fù)型。通過前沿層析法 (FAC) 對(duì)Gal6的結(jié)合特異性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：Gal6和具有分枝結(jié)構(gòu)的的復(fù)雜型N-連接的糖鏈的結(jié)合力最強(qiáng)，隨著分枝的增加，親和常數(shù)也隨之增加。Gal6最傾向于結(jié)合含半乳糖且具有分枝結(jié)構(gòu)的N-連接的糖鏈。 PNA在組化分析中，PNA是用來檢測(cè)T抗原（Gal1-3GalNAc結(jié)構(gòu)）的，T抗原在黏蛋白（如白細(xì)胞唾液酸蛋白、血型糖蛋白A）的O-連接的糖鏈中廣泛存在。PNA一般選擇性地結(jié)合在廣泛存在于O-連接的糖鏈的T抗原上。2.4 糖基化蛋白質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)2.4.1 放射性標(biāo)記方法可將3H、14C標(biāo)記的糖加入到培養(yǎng)的細(xì)胞或組織中，通過放射自顯影檢測(cè)糖蛋白。此法靈敏度高，

48、但是放射性標(biāo)記過程長、緩慢、危險(xiǎn)、花費(fèi)較大。2.4.2 熒光染色檢測(cè)法丹磺酰肼作為酸性品紅染料的熒光替代試劑可用來檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠中的糖蛋白。膠中的糖蛋白先經(jīng)過高碘酸氧化，形成醛，然后與丹磺酰肼反應(yīng)，形成腙，接著用硼氫化鈉還原成肼的衍生物。這一連串的反應(yīng)需要將膠置于酸化的DMSO中，60溫育2小時(shí)，并且需要高濃度的丹磺酰肼染料(0.5-2.0 g/L)。2.4.3 與凝集素聯(lián)用的染色檢測(cè)方法蛋白質(zhì)經(jīng)過PAGE分離，印跡在聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上，然后與結(jié)合了堿性磷酸酯酶(alkaline phosphase, AP)的凝集素一起溫育，再經(jīng)過堿性磷酸酯酶酶解十二烷基二甲基氧化胺 (DD

49、AO, AP的熒光底物）磷酸鹽，生成長波的紅色熒光的DDAO來檢測(cè)。此法的靈敏度為15ng，依賴于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和糖基化程度。2.4.4 其他檢測(cè)方法可用酶解或化學(xué)裂解法將糖鏈從糖蛋白中釋放出來，經(jīng)過2-氨基苯丙酸等標(biāo)記，用毛細(xì)管電泳或HPLC等分離，再由諸如MS、NMR等檢測(cè)器來進(jìn)行檢測(cè)。2.5 質(zhì)譜法在蛋白質(zhì)糖基化研究中的應(yīng)用2.5.1 糖基化蛋白質(zhì)分析組成糖鏈的糖基種類繁多，連接方式多樣，主要包括N-連接糖鏈和O-連接糖鏈。糖蛋白存在著復(fù)雜的微觀不均一性(microheterogencity)，即在蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全相同的情況下，由于糖鏈的組成或連接方式的不同而形成多種糖蛋白亞型。糖蛋

50、白的這種復(fù)雜性在其生理功能上有其重要意義，但卻給糖蛋白的分析帶來了極大的困難。糖蛋白的分析主要包括以下幾個(gè)層次： 糖蛋白位點(diǎn)的確定其困難在于有的糖蛋白的糖基化位點(diǎn)多，而且包括了N-和O-糖基化位點(diǎn)，不容易采用單一方法確定。傳統(tǒng)的方法是通過Edman降解和糖苷酶酶解或化學(xué)降解法相結(jié)合來確定位點(diǎn)，但對(duì)于多位點(diǎn)糖基化和不容易被糖苷酶去除的O-糖鏈，此法難以奏效。 糖鏈的組成，即糖鏈?zhǔn)怯赡男﹩翁墙M成N-糖鏈有固定的五糖核心GlcNAc2Man3，核心外再連接有不同長度的糖鏈，而O-糖鏈則比較多樣化。傳統(tǒng)方法采用酶解或化學(xué)降解方法獲得糖鏈后，水解成單糖，用陰離子交換色譜，然后與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照。但這種方法僅能確定糖蛋白總的糖基組成，而無法獲得某一位點(diǎn)的糖鏈組成。 糖鏈不均一性的鑒定及各成分間的比例困難在于難以分離得到每種成分并進(jìn)行分析。 糖鏈的連接順序 糖鏈的分枝和連接方式 糖基異頭構(gòu)型的分析這是由于糖基化的分析困難，更需要一種有效的分析手段。在1980s年代，Carr和Robert采用快原子轟擊質(zhì)譜分析了經(jīng)N-糖苷酶F處理前后的