大鼠→小鼠異種骨髓移植耐受誘導(dǎo)的研究

1、    大鼠小鼠異種骨髓移植耐受誘導(dǎo)的研究        【摘要】目的探索適合臨床應(yīng)用的有效誘導(dǎo)異種骨髓移植耐受的方案。方法給亞致死照射（5Gy）的C57BL/6(B6)小鼠尾靜脈注射4×107Lewis大鼠骨髓細(xì)胞,2天后腹腔注射環(huán)磷酰胺150mg/kg。分別于骨髓移植后30天、60天、90天，對(duì)受體小鼠外周血、脾臟及胸腺中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光染色，作FACS分析，檢測(cè)大鼠源性的骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)植活情況，并于30天后，對(duì)受體小鼠作混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）

2、及遲發(fā)超敏反應(yīng)（DTH）檢查。結(jié)果經(jīng)處理的B6小鼠外周血、脾臟及胸腺中檢測(cè)出了大鼠源性的骨髓嵌合體,嵌合體可長(zhǎng)期存在(>3個(gè)月)。MLR及DTH檢查證明B6小鼠對(duì)Lewis大鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生特異性耐受，對(duì)無(wú)關(guān)第3者DA大鼠及BALB/c小鼠的脾細(xì)胞仍表現(xiàn)出強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。結(jié)論在B6小鼠體內(nèi)成功地誘導(dǎo)出了供者特異性的大鼠小鼠異種骨髓移植耐受。【關(guān)鍵詞】嵌合體免疫耐受骨髓移植，異種 Study on the induction of xenogeneic tolerance of rat to mouse bone marrow transplantationSong Xianyuan* ,

3、Yuan Xueli, Xie Shusheng. *Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083 【Abstract】 ObjectiveTo establish an effective protocol for potential clinical usage in inducing donorspecific tolerance across xenogeneic barriers. MethodsC57BL/6 (B6) mice were conditioned with 5 Gy subl

4、ethal total body irradiation (TBI), followed by infusion of 4× 107 Lewis rat bone marrow cells on day 0, then were intraperitonially administered 150 mg/kg cyclophosphamide (CP) on day 2. Recipients were characterized for engraftment with xenogeneic bone marrow cells by using fluorescence activ

5、ated cell sorter (FACS) to determine the percentage of rat origin cells in the peripheral blood lymphocytes(PBL), splenic and thymic lymphoid cells on day 30, 60 and 90. Mixed lymphocyte reaction (MLR) and delayed type hypersensitivity (DTH) assay were performed on day 30 to examine the tolerance st

6、atus. ResultsRat lymphoid chimeras were reliable present in the tolerant B6 mice for more than 3 months. B6 recipients were specifically tolerant to host xenoantigens in MLR and DTH assays, but were still immunocompetent to MHCdisparate third party BALB/c mouse or DA rat stimulator cells. Conclusion

7、A durable rat to mouse xenogeneic bone marrow transplantation tolerance was achieved in this modal. 【Key words】 Chimerism Immunotolerance Bone marrow transplantation,xenogeneic 目前器官移植中，由于供者器官短缺的問(wèn)題日益嚴(yán)重,異種移植(Xenotransplantation)已成為當(dāng)今器官移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。鑒于異種移植排斥反應(yīng)強(qiáng)烈，而協(xié)調(diào)性（concordant）異種動(dòng)物，如大、小鼠之間，不存在天然抗體，對(duì)異種移植物不

8、會(huì)發(fā)生超急排斥(HyperacuteRejection,HAR)，所以比較適合于用來(lái)研究異種移植耐受。目前這方面的研究主要在鼠類(lèi)間進(jìn)行。Ilstad等1曾將致死照射（9.5Gy）小鼠輸入大鼠骨髓細(xì)胞(BMC)，在小鼠體內(nèi)建立了大、小鼠骨髓嵌合體，使受體小鼠獲得了異種移植耐受，對(duì)植入的供者組織或器官不發(fā)生排斥。我們?cè)谕N移植中應(yīng)用輸注供者骨髓和脾細(xì)胞，然后再注射單劑環(huán)磷酰胺(CTX)的方法建立了同種異基因小鼠間的深度移植耐受2。在此基礎(chǔ)上，我們用亞致死照射聯(lián)合環(huán)磷酰胺的方法成功地誘導(dǎo)出了大鼠小鼠供者特異的異種骨髓移植耐受。報(bào)告如下。材料和方法1動(dòng)物810周齡C57BL/6(B6)小鼠及BALB

9、/c小鼠，由北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。68周齡DA大鼠及Lewis大鼠由本室引進(jìn)并繁殖。動(dòng)物性別不限。2異種骨髓嵌合體模型的建立(Lewis大鼠B6小鼠)在第0天，以5GyCo源照射B6小鼠，4小時(shí)內(nèi)尾靜脈輸入4×107大鼠骨髓細(xì)胞，第2天，部分小鼠給予腹腔內(nèi)注射CTX150mg/kg；以單純照射小鼠作對(duì)照。3異基因嵌合體的測(cè)定分別制備受體小鼠外周血、胸腺及脾臟的淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度至2×107/ml，取上述細(xì)胞50l加入Eppendorff管，加入純化的兔抗大鼠淋巴細(xì)胞抗體（本室制備）50l，置4，30分鐘，PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入FITC熒光標(biāo)記羊抗兔IgG二抗5

10、0l，置4、30分鐘，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1ml熒光抗體保存液，置4保存,以流式細(xì)胞儀(FACScan;BectonDickinson)測(cè)定嵌合細(xì)胞含量。4遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)檢查于小鼠腹股溝皮下注射1×107大鼠脾細(xì)胞預(yù)致敏，7天后于右后腳掌注射1×107(50l)相同的脾細(xì)胞，左后腳掌注射50lHanks液作對(duì)照。24小時(shí)后測(cè)量?jī)赡_掌的厚度，取其差值作為DTH指標(biāo)。5單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)大鼠骨髓移植后,分別取大、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞作單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，反應(yīng)細(xì)胞與經(jīng)20Gy照射的刺激細(xì)胞各1

11、00l，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37、體積分?jǐn)?shù)為5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)，每孔加入5mg/ml的MTT液10l，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，2000r/min離心20分鐘，小心吸出上清，每孔加入100g/LSDS液100l，振蕩混勻，靜置4小時(shí)，使沉淀物充分溶解，在960全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度A600nm值。6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以<"01 (888 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317175225790" 14 16>±s表示，利用Excel數(shù)據(jù)分析功能進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果1小鼠外周血、胸腺嵌合體檢查骨髓移植3

12、0天時(shí)，單純輸注骨髓的對(duì)照小鼠未檢測(cè)到嵌合體的存在，經(jīng)5Gy照射后進(jìn)行Lewis骨髓移植（LBMT）的B6小鼠外周血、胸腺皆能查到大鼠嵌合體的存在，嵌合水平在519（1），但在移植后60天已檢測(cè)不到嵌合體，而照射LBMTCTX耐受誘導(dǎo)組的小鼠于移植后90天仍可檢測(cè)到低水平的大鼠淋巴細(xì)胞(15)，其在骨髓移植后30天、60天的嵌合水平依次為1243，925（2）。在脾臟中也查到類(lèi)似結(jié)果。說(shuō)明經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，B6小鼠對(duì)Lewis大鼠的骨髓細(xì)胞已產(chǎn)生較持久的耐受。    a:陰性對(duì)照；b:二抗對(duì)照；c:5GyLBMT;d:5GyLBMTCTX;e:陽(yáng)性對(duì)照1FAC

13、S方法對(duì)不同組小鼠骨髓移植后30天外周血嵌合體檢查    a:5GyLBMT組;b:5GyLBMTCTX組2FACS方法檢查不同時(shí)期耐受小鼠胸腺內(nèi)大鼠淋巴細(xì)胞嵌合體水2DTH結(jié)果大鼠骨髓移植60天后，照射LBMTCTX耐受誘導(dǎo)組（組4）B6小鼠對(duì)供者Lewis大鼠脾細(xì)胞的DTH反應(yīng)仍在較低水平，其足掌脹度為(0.23±0.035)mm，較單純照射對(duì)照組（組1）(0.76±0.09)mm及未輸骨髓組（組2）（0.64±0.05)mm或未加CTX組（組3）（0.54±0.03)mm差異有顯著性（P<0.01, P

14、<0.05, P<0.05） 。而組2、組3與組1比較差異無(wú)顯著性（0.05）。各LBMT組小鼠對(duì)無(wú)關(guān)第3者DA大鼠的脾細(xì)胞都有正常DTH反應(yīng)，各組之間差異無(wú)顯著性（表1）。骨髓移植90天后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無(wú)明顯變化。說(shuō)明耐受是有特異性的，且隨時(shí)間推移，耐受狀態(tài)并未打破。表1骨髓移植后60天耐受B6小鼠對(duì)大鼠供體性DTH反應(yīng)（<"01 (888 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317175225790" 14 16>±s）組別5GyCTXLBMT致敏脾細(xì)胞樣本數(shù)足掌脹度（mm)1L

15、ewis60.76±0092Lewis6064±005*3Lewis6054±003*4Lewis6023±0035DA6080±0056DA6076±0067DA6079±0078DA6082±008注：*與組1比較，P>0.05;與組1，7比較P<0.01；與組2，3比較P<0.05;5，6，7，8各組間比 較 ,P>0.053MLR結(jié)果骨髓移植60天時(shí)，照射LBMTCTX耐受誘導(dǎo)組B6小鼠脾細(xì)胞對(duì)供者Lewis大鼠脾細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)特異性降低（P<0.01），但對(duì)無(wú)關(guān)第3者

16、DA大鼠及BALB/c小鼠的脾細(xì)胞仍有強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)（P<0.01）（3）。骨髓移植90天后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果無(wú)明顯變化。    3耐受小鼠對(duì)供體特異性MLR結(jié)果討論1免疫排斥的種屬屏障是異種移植的難題。在不協(xié)調(diào)性（discordant）的異種動(dòng)物之間，由于天然抗體的存在，異種器官移植后立即發(fā)生HAR，移植物在幾分鐘內(nèi)就可以被排斥3。目前用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如轉(zhuǎn)人衰變加速因子（Decay?acceleratingfactor,DAF）的轉(zhuǎn)基因豬，通過(guò)抑制補(bǔ)體活化來(lái)防止HAR，已取得一定成功4，但除HAR外，遲發(fā)型異種排斥（delayedxenograft

17、rejection,DXR）以及T細(xì)胞介導(dǎo)的急、慢性排斥也是異種排斥的重要屏障5。研究表明，細(xì)胞介導(dǎo)的DXR對(duì)環(huán)孢菌素（CsA）等免疫抑制劑不敏感6，因此，誘導(dǎo)異種動(dòng)物之間的移植耐受是解決DXR的重要方法。Ilstad等在1984年報(bào)道用致死量照射方法處理受體小鼠，然后將大鼠的BMC與同系小鼠BMC混合，輸給受體小鼠（ratmousemouse），從而誘導(dǎo)形成了大、小鼠混合嵌合體，受體小鼠可接受供者來(lái)源的組織、器官而不發(fā)生排斥。但大劑量照射的作用過(guò)于強(qiáng)烈，不適用于臨床，而降低照射劑量后，由于照射小鼠體內(nèi)殘存的外周成熟T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的移植排斥作用，植入的異種骨髓細(xì)胞不易存活。為

18、此，Sharabi等對(duì)小鼠進(jìn)行亞致死量照射后，再用抗小鼠T細(xì)胞單抗（Thy?1.2），抗小鼠CD4、CD8單抗，抗NK細(xì)胞單抗（NK1.1）等一系列抑制小鼠T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能的措施，也成功地使大鼠骨髓細(xì)胞在小鼠體內(nèi)植活7,但方法較為繁瑣，試劑昂貴，不易推廣。為了簡(jiǎn)化誘導(dǎo)方案，探索有效的適合臨床應(yīng)用的異種移植耐受誘導(dǎo)的方法，我們以亞致死劑量全身照射聯(lián)合單劑CTX腹腔注射進(jìn)行異種骨髓移植，獲得了較好的效果。2CTX是臨床常用的免疫抑制藥物，NK細(xì)胞及增殖細(xì)胞都對(duì)CTX敏感8。由于注入體內(nèi)的異種抗原會(huì)引起相應(yīng)T細(xì)胞克隆增殖，所以在LBMT2天后，腹腔注射CTX能抑制NK細(xì)胞活性，并能殺死處于增殖中

19、的T細(xì)胞克隆，造成小鼠對(duì)大鼠相應(yīng)抗原的T細(xì)胞克隆大量死亡，為植入的大鼠骨髓細(xì)胞創(chuàng)造了建立嵌合體的條件。我們?cè)眠@種方法，成功地誘導(dǎo)出跨越H?2屏障的同種異基因移植耐受9。本研究結(jié)果表明，只經(jīng)亞致死量照射，單純輸入大鼠的骨髓細(xì)胞存活不能超過(guò)60天，但經(jīng)CTX注射誘導(dǎo)耐受后就可延長(zhǎng)90天以上。耐受小鼠對(duì)供體大鼠的MLR和DTH長(zhǎng)期保持特異的抑制狀態(tài)，而對(duì)無(wú)關(guān)第3者大鼠及小鼠的脾細(xì)胞仍有強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)，說(shuō)明小鼠對(duì)供體大鼠組織細(xì)胞的耐受是具有特異性的。這與非特異免疫抑制有本質(zhì)差別。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輸入的供者大鼠骨髓細(xì)胞可以在小鼠骨髓和胸腺中形成中樞嵌合體，通過(guò)胸腺選擇獲得中樞耐受，并可以遷移到脾臟及外

20、周血中，形成外周嵌合體，在外周耐受的形成中起重要作用10。供者大鼠的造血細(xì)胞與受體小鼠的造血細(xì)胞共存，使受體免疫系統(tǒng)把供者組織抗原看作為“自己”成分，從而可以接受供者的任何組織器官而不發(fā)生排斥。我們發(fā)現(xiàn)，雖然中樞嵌合狀態(tài)已經(jīng)建立，大鼠小鼠骨髓移植耐受已經(jīng)形成，在骨髓移植60天，只經(jīng)照射的小鼠已不存在大鼠的骨髓細(xì)胞，但此時(shí)耐受誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)大鼠骨髓細(xì)胞仍高達(dá)925，說(shuō)明其已獲得對(duì)大鼠骨髓細(xì)胞的耐受。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠骨髓細(xì)胞在嵌合小鼠的體內(nèi)比例在逐漸降低，由于耐受小鼠對(duì)供者大鼠脾細(xì)胞的DHT及MLR反應(yīng)在60天時(shí)仍然表現(xiàn)為特異性的耐受狀態(tài)，排除了這種大鼠骨髓細(xì)胞比例降低是由于移植排斥引起的可能性

21、。研究發(fā)現(xiàn)，接受豬腎移植的猴子會(huì)罹患嚴(yán)重的貧血，說(shuō)明豬紅細(xì)胞生成素在猴的體內(nèi)并不能很好地行使生理功能。此外，接受狒狒肝移植的人血清膽固醇水平相對(duì)較低，而且其血尿酸水平明顯較正常人降低，因?yàn)獒翎舻母闻K與人的不同，并不產(chǎn)生尿酸11。這種異種移植中由于“分子不相容性”(molecularincompatibility)引起的移植物功能障礙，也許說(shuō)明小鼠的造血微環(huán)境可能并不完全適合大鼠骨髓的生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移將逐漸被小鼠的骨髓造血細(xì)胞所替代。這種異種移植的種屬屏障也是異種移植需要解決的重要問(wèn)題。本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金(39770699)資助作者單位：宋嫻媛謝蜀生（北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系100083）

22、苑學(xué)禮（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所）參考文獻(xiàn)1Ilstad ST, Sachs DH. Reconstitution with syngeneic and allogeneic or xenogeneic bone marrow leads to specific acceptance of allografts or xenografts. Nature, 1984, 307: 168171. 2白愛(ài)林，謝蜀生，龍振洲.成年小鼠皮膚移植耐受誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)免疫學(xué)雜志，1994, 10: 274276. 3Parker W, Saadi S, Lin SS, e

23、t al. Transplantation of discordant xenografts: a challenge revisited. Immunology Today, 1996, 17: 373378. 4Dalmasso AP, Vercellotti GM, Platt JL, et al. Inhibition of complement? mediated endothelial cell cytotoxicity by decayaccelerating factor. Potential for prevention of xenograft hyperacute rej

24、ection. Transplantation, 1991, 52: 530534. 5Bach FH, Winkler H, Ferran C，et al.Delayed xenograft rejection. Immunology Today, 1996,17: 379384. Bach FH, Ferran MS, Wrighton C, et al. Modification of vascular responses in xenotransplantation: inflammation and apoptosis. Nature Med，1997, 3: 944948. 7Sharabi Y, Aksentijevich