冰片作用下替莫唑胺在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

1、冰片作用下替莫唑胺在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究李紅霞，黃佳，史衛(wèi)忠，趙志剛*（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥劑科， 北京100050）摘要：目的 建立家兔血漿和腦脊液中替莫唑胺的高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)方法，比較冰片作用后替莫唑胺藥動(dòng)學(xué)的改變。方法 健康日本大耳白兔（2.5 0.5kg），隨機(jī)分為冰片組和對(duì)照組。冰片組以冰片0.7gkg-1的劑量灌胃1h后，替莫唑胺12mgkg-1灌胃；對(duì)照組灌服等量75乙醇后，相同劑量灌胃替莫唑胺。采集不同時(shí)間點(diǎn)的血液和腦脊液， HPLC法(內(nèi)標(biāo)甲硝唑，Kromasil C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)329nm)測(cè)定替莫唑胺的濃度，藥物濃度時(shí)間曲線經(jīng)3P97程序擬合

2、，進(jìn)行自動(dòng)模型判別和參數(shù)計(jì)算。結(jié)果 替莫唑胺在0.120gML-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其血液回歸方程為p0.0723c610-6 (r0.9998)；腦脊液回歸方程為p0.0734c0.0054 (r0.9997)；平均回收率在75以上。替莫唑胺血液相符合一室模型，腦脊液相符合二室模型。合用冰片，替莫唑胺的血液和腦脊液的Tpeak、Cmax和AUC均增加，血腦屏障通透率提高15.63%。結(jié)論 冰片可提高替莫唑胺的生物利用度，增加其在腦脊液的分布,有效促進(jìn)替莫唑胺通過(guò)血腦屏障。關(guān)鍵詞：替莫唑胺；冰片；HPLC；血腦屏障；藥代動(dòng)力學(xué)中圖分類號(hào) ：R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ：BThe Pharmac

3、okinetics of Temozolomide in Rabbits after Intragastric Administration of BorneolLI Hong-xia, HUANG Jia, Shi Wei-zhong, ZHAO Zhi-gang *（Department of pharmacy, Beijing Tiantan Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China)Abstract: OBJECTIVE: To develop the high-performanc

4、e liquid chromatographic analysis of temozolomide (TMZ) in rabbit plasma and cerebrospinal fluid (CSF); To compare the change of pharmacokinetics of TMZ after intragastric administration of Borneol. METHODS: White 基金項(xiàng)目北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)個(gè)人資助項(xiàng)目(編號(hào):20061D0300415). 作者簡(jiǎn)介：李紅霞, 女, 碩士研究生 通訊作者：趙志剛, 男, 主任藥師, Tel:

5 Rabbits（2.5 0.5 kg）were randomly divided into control group and borneol group. The concentrations of TMZ in plasma and cerebrospinal fluid were determined by HPLC which involved selection of metronidazole as internal standard (I.S) followed by separation on a reversedphase C-18 column

6、and quantification by UV absorbance at 329 nm. Blood and CSF samples wereobtained after intragastric administration of TMZ 12 mgkg-1 with/without Borneol 0.7gkg-1 at different time.The plasma/CSF concentration-time curves were fitted and the pharmacokinetic parameters were calculated with 3P97 pract

7、ical pharmacokinetic program. Results: The standard curve of TMZ was linear over the range 0.1-20gml-1. Its regression equation was p0.0723c610-6 (r0.9998) in plasma and p0.0734c0.0054 (r0.9997) in CSF. The average recovery of temozolomide was more than 75%.The pharmacokinetics of temozolomide in ra

8、bbit could be respectively described by a two compartment model in plasma and a one compartment model in CSF. Tpeak, Cmax and AUC were increased in borneol group and the permeability of Blood Brain Barrier (BBB) was increased by 15.63%. Conclusion: Borneol can increase the bioavailability of TMZ in

9、plasma and CSF. The increase of concentration of temozolomide in the CSF of rabbits suggests that borneol can improve the permeability of BBB.Key words:Temozolomide, Borneol, HPLC, BBB, pharmacokinetics中圖分類號(hào)：R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B血腦屏障(Blood Brain Barrier, BBB)阻礙外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入腦組織，對(duì)大腦起到保護(hù)作用，但也限制了藥物的進(jìn)入，使藥物難以在腦組織中達(dá)到有效濃

10、度而不能充分發(fā)揮療效。冰片具有“芳香走竄”的作用,現(xiàn)代藥理研究表明冰片可促進(jìn)血腦屏障開放,增加藥物在腦組織中的分布（1）。替莫唑胺（temozolomide，見(jiàn)圖1）是一種新型的口服化療藥物，口服后可被完全吸收，生物利用度高，組織分布性好（2）。該藥可通過(guò)血腦屏障，故對(duì)腦部腫瘤療效較好，主要用于治療多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。圖1替莫唑胺結(jié)構(gòu)式Fig 1. Structure of temozolomide本研究改進(jìn)了家兔血漿和腦脊液中替莫唑胺的HPLC測(cè)定方法，以甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，減小誤差提高了準(zhǔn)確性。平行對(duì)照研究冰片作用后替莫唑胺在血液和腦脊液中的濃度變化，探討冰片對(duì)家兔體內(nèi)替莫唑胺藥代動(dòng)力學(xué)

11、的影響。1 材料和方法1.1 藥品與試劑天然冰片（吉安地區(qū)林科所天然冰片廠，批號(hào)：060804）；替莫唑胺對(duì)照品（天津天士力藥物研究所）；內(nèi)標(biāo)甲硝唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100191200305）；水合氯醛（北京化學(xué)試劑廠）；鹽酸、乙酸乙酯、冰醋酸均為分析純（北京化學(xué)試劑廠）；甲醇為色譜純（Fisher公司）。1.2 儀器Waters 510高效液相色譜儀（Waters484紫外檢測(cè)器）；色譜柱：Kromasil C18柱（5m，4.6mm250mm）；流動(dòng)相：甲醇0.5乙酸（20：80，v/v）；流速：1mlmin-1；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：329 nm。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日

12、本大耳白兔 (2.5 0.5 kg) 30只（北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，SCXK京200200005）。兼用。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 樣品采集將健康的日本大耳白兔隨機(jī)分為兩組（冰片組16只，對(duì)照組14只），空腹8h。稱量實(shí)驗(yàn)兔體重，冰片組灌胃冰片0.7gkg-1(75乙醇溶解)，對(duì)照組灌服等量75乙醇，1h后兩組動(dòng)物均20水合氯醛56mlkg-1腹腔注射麻醉，以側(cè)臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，血管穿刺針植入小腦延髓池（寰枕池）取腦脊液，耳中央動(dòng)脈留置穿刺針取血。兩組均以12mgkg-1的劑量，將濃度為6.0mgml-1的替莫唑胺灌胃，分別在給藥的15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、2.5h

13、、3h、4h、6h、8h、10h、12h取血和腦脊液置于肝素化的離心管中，離心(3500 r.p.m.)10min，分離血漿1.0ml/腦脊液0.2ml，加內(nèi)標(biāo)溶液（甲硝唑100gml-1）100l/血液，20l/腦脊液，1molL-1 HCl酸化（鹽酸與樣品的比值為1：9），置-20C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.2 樣品預(yù)處理血液：取0.5ml酸化血漿中，加入提取溶劑乙酸乙酯3ml，渦流混合l min，往復(fù)振蕩10 min，離心5 min，分取上層液于另一試管中，40C氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物加?00l流動(dòng)相溶解，渦流混合，取20l進(jìn)行HPLC-UV分析。腦脊液：取酸化腦脊液0.2ml中，加入提取溶劑乙酸乙

14、酯1.5ml，渦流混合l min，往復(fù)振蕩10 min，離心5 min，分取上層液于另一試管中，40C氮?dú)饬飨麓蹈桑瑲埩粑锛尤?00l流動(dòng)相溶解，渦流混合，取20l進(jìn)行HPLC-UV分析。2.3 色譜分離的結(jié)果以流動(dòng)性作為溶劑，替莫唑胺的保留時(shí)間為5 min左右，色譜圖的雜峰較少，沒(méi)有明顯的雜質(zhì)干擾；內(nèi)標(biāo)甲硝唑的峰在7.58min左右，兩者得到良好的分離（如圖2所示），不影響替莫唑胺的測(cè)定。CBA EDF 圖2 替莫唑胺色譜圖A. 空白兔血漿加入內(nèi)標(biāo)（甲硝唑，10gml-1）；B. 空白兔血漿加入替莫唑胺和內(nèi)標(biāo)；C. 一只家兔灌胃給予0.7gkg-1的替莫唑胺后替莫唑胺的血漿樣品；D. 空白兔

15、腦脊液加入內(nèi)標(biāo)（甲硝唑，10gml-1）；E. 空白兔腦脊液加入替莫唑胺和內(nèi)標(biāo)；F一只家兔灌胃給予0.7gkg-1的替莫唑胺后替莫唑胺的腦脊液樣品. 1-替莫唑胺; 2-內(nèi)標(biāo)Fig2 Typical chromatograms of temozolomideA. blank plasma spiked with IS (Metronidazole, 10gml-1); B. plasma spiked with temozolomide (10gml-1) and IS; C. plasma obtained from a rabbit after intragastric administr

16、ation of 0.7gkg-1 temozolomide; D. blank CSF spiked with IS (Metronidazole, 10gml-1); E. CSF spiked with temozolomide (10gml-1) and IS; F. CSF obtained from a rabbit after Intragastric Administration of 0.7gkg-1 temozolomide. 1- temozolomide, 2-IS2.4 最低檢測(cè)限試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)備液，分別用血液、腦脊液稀釋，得到線性范圍的最低濃度0.1g/ml的樣品

17、試液，經(jīng)處理后進(jìn)樣檢測(cè)，S/N10可知0.1g/ml在最低檢測(cè)限之上。2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程精密稱定替莫唑胺，以甲醇0.5乙酸（20：80，v/v）溶解，配成1.0mgml-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，通過(guò)適當(dāng)?shù)谋侗认♂屌渲瞥鰸舛确謩e為200、150、100、50、25、15、5、2、1gml-1的系列儲(chǔ)備溶液，放置于-20C冰箱儲(chǔ)存。精密吸取替莫唑胺系列標(biāo)準(zhǔn)貯備液100l，置于離心管中氮?dú)獯蹈?，然后分別加入1.0ml兔空白血漿，即得20.0、15.0、10.0、5.0、2.5、1.5、0.5、0.2、0.1gml-1空白血漿替莫唑胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加100gml-1的甲硝唑溶液100l，1molL-1

18、HCl酸化（鹽酸與樣品的比值為1：9）后，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，以濃度（c）對(duì)替莫唑胺/甲硝唑峰面積（p=TMZ/I.S）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為p0.0723c610-6 (r0.9998)。腦脊液的處理方法與血液相同，得到回歸方程為：p0.0734c0.0054 (r0.9997)。2.6 精密度和回收率配制0.2gml-1（低）、1.5gml-1（中）、15gml-1（高）三個(gè)質(zhì)控濃度，測(cè)定回收率和日內(nèi)、日間精密度。（n5）表1 方法的日內(nèi)、日間精密度和回收率 (n=5)Table 1. Intra-day, inter-day precision and recovery of t

19、he method (n=5)濃度g/ml日內(nèi)精密度日間精密度相對(duì)回收率絕對(duì)回收率血液0.21.80413.2183.1875.541.51.0242.40591.2482.66150.60114.03691.0780.56腦脊液0.27.4449.20482.2970.731.51.4134.22096.8376.68150.5561.94292.1183.952.7 藥代動(dòng)力學(xué)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用3P97軟件對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)替莫唑胺的濃度進(jìn)行擬合，進(jìn)行自動(dòng)模型判別和參數(shù)計(jì)算。兩組之間藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。3 結(jié)果3.1 藥時(shí)曲線 以替莫唑胺的平均濃度和標(biāo)準(zhǔn)差時(shí)間作藥時(shí)曲線圖如圖3所示

20、。與對(duì)照組相比，同一時(shí)間點(diǎn)冰片組無(wú)論是血液還是腦脊液的替莫唑胺的濃度均明顯增加（p0.01）。圖3 家兔灌胃給予替莫唑胺后血漿/腦脊液中替莫唑胺的平均濃度-時(shí)間曲線Fig 3 Mean Plasma/CSF concentration-time curves of TM after intragastric administration in rabbits3.2藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)參數(shù)計(jì)算測(cè)定兔給藥后不同時(shí)間點(diǎn)腦脊液和血液的藥物濃度，藥物濃度時(shí)間數(shù)據(jù)經(jīng)3P97軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行自動(dòng)模型判別及參數(shù)計(jì)算，以R2（確定系數(shù)）和AIC（akaikes information criterion）判斷模型和

21、權(quán)重。判斷原則：R2越大、AIC越小，模型擬合越好。結(jié)果顯示，血液相符合一室模型，腦脊液相采用二室模型。其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列表如下：表2. 冰片對(duì)替莫唑胺在家兔血漿中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 2. The effects of borneol on pharmacokinetic parameters of TMZ in plasma of rabbits參數(shù)單位冰片組對(duì)照組Agml-1336.459.32Keh-10.97230.6509Kah-11.03870.8221T1/2(Ka)h0.66730.8431T1/2(Ke)h0.71291.065Tpeakh0.99491.364C

22、maxgml-110.408.087AUC (gml-1)h22.1218.99Cl/F(s)(mgKg-1)/h/(gml-1)0.42680.6319V/F(c)(mgKg-1)/( gml-1)0.43900.9709表3. 冰片對(duì)替莫唑胺在家兔腦脊液中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 3. The effects of borneol on pharmacokinetic parameters of TMZ in CSF of rabbits參數(shù)單位冰片組對(duì)照組Agml-111.9113.86alphah-11.5582.703Bgml-128.105.952betah-10.69970

23、.5218Kah-11.0111.850V/F(c)(mgKg-1)/( gml-1)5.3995.641T1/2 h0.44490.2565T1/2h0.99071.329T1/2Kah0.68540.3748K21h-14.0433.859K10h-10.26960.3654K12h-12.0557.448AUC(gml-1)h10.245.821Cl(s)(mgKg-1)/h/(gml-1)1.4562.062Tpeakh1.6651.635Cmaxgml-13.2271.740參數(shù)比較.1達(dá)峰時(shí)間血液相：冰片組比對(duì)照組減少27.21%(0.99hVs1.36h)（p0.05）；腦脊液相

24、：兩組的達(dá)峰時(shí)間(1.67hVs1.64h)無(wú)明顯差異。.2峰濃度血液相：冰片組比對(duì)照組增加28.43%(10.39gml-1Vs8.09gml-1)（p0.01）；腦脊液相：冰片組比對(duì)照組增加85.63% (3.23gml-1Vs1.74gml-1)（p0.01）。.3 AUC單次口服替莫唑胺12mg/kg，冰片組與對(duì)照組相比，血液AUC增加了16.54% (22.12gml-1hVs18.98gml-1h)( p0.01)；腦脊液AUC增加了75.94% (10.24gml-1h Vs5.82gml-1h)( p0.01)；血腦屏障的通透率AUC腦/AUC血，冰片組比對(duì)照組增加15.63%

25、 ( 46.29%Vs30.66%) (p0.01)，均具有顯著性差異。4討論4.1內(nèi)標(biāo)物的選擇HPLC法測(cè)定替莫唑胺的濃度是目前比較常用的方法（5，6），國(guó)外主要采用內(nèi)標(biāo)法（ethazolastone為內(nèi)標(biāo)）（5），由于ethazolastone合成困難，國(guó)內(nèi)難以得到，故國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)均為外標(biāo)(6)法，降低了測(cè)量準(zhǔn)確度。本文以甲硝唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，取得了良好的效果，提高了測(cè)量精度。4.2流動(dòng)相的選擇TM 為弱堿性藥物，酸性環(huán)境下穩(wěn)定。在流動(dòng)相選擇過(guò)程中，我們?cè)谝酝墨I(xiàn)報(bào)道（5, 6）的基礎(chǔ)上調(diào)整比例，實(shí)驗(yàn)表明, TM 在甲醇0.5乙酸（20：80，v/v）溶液中穩(wěn)定，室溫放置24 h也不影響測(cè)定結(jié)果。4

26、.3家兔體內(nèi)替莫唑胺的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程家兔替莫唑胺灌胃后，吸收迅速、完全，血液相達(dá)峰時(shí)間1.36h左右，生物利用度高，能夠通過(guò)血腦屏障，其腦脊液/血漿藥物濃度比接近30%，與國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道相符。4.4 冰片的作用有文獻(xiàn)報(bào)道，冰片可促進(jìn)胃腸道對(duì)其他藥物的吸收（1），提高血藥濃度（7）。本研究中，合用冰片后家兔替莫唑胺的T1/2(Ka)、Tpeak減小，Cmax升高，AUC增加，說(shuō)明冰片能夠促進(jìn)胃腸道對(duì)替莫唑胺的吸收，提高替莫唑胺的生物利用度。直接測(cè)定腦組織內(nèi)藥物濃度過(guò)程繁瑣，通過(guò)采集與BBB通透性相關(guān)的腦脊液，測(cè)定其中的藥物濃度，描述腦脊液中的藥物濃度時(shí)間(C-T) 曲線，可間接獲得BBB開放的參考數(shù)據(jù)。冰片可促進(jìn)血腦屏障開放,使藥物的腦組織濃度增加（1）。合用冰片后，替莫唑胺腦脊液中的Cmax和AUC顯著升高，升高幅度超過(guò)同時(shí)間血液的增幅，即血腦屏障通透性提高，提示冰片能夠促進(jìn)替莫唑胺透過(guò)血腦屏障，增加其在腦脊液中的分布。這一研究結(jié)果為開發(fā)冰片與替莫唑胺的配伍，減少替莫唑胺的用量，增強(qiáng)療效提供了可能性。REFERENCES1 Liu Y F, Zhang B L. Progress of research on pharmacology of borneolJ. Acta Chin Med and Pharmacol (中醫(yī)藥學(xué)報(bào)), 2003, 31 (6): 55