活血化瘀方藥對(duì)Poresky 大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞的影響(一)

1、活血化瘀方藥對(duì)Poresky 大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞的影響(一)    【摘要】 ：目的觀察活血化瘀方藥對(duì)Poresky多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞功能及形態(tài)的影響。方法依照Poretsky法建立PCOS大鼠模型，隨機(jī)分為中藥組、模型組，并設(shè)立正常組作對(duì)照。測(cè)定各組血清FSH、LH、T、INS及血漿ET、PAI1的水平，電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果模型組內(nèi)皮細(xì)胞間的連接失去正常形態(tài)，基底膜不連續(xù)，細(xì)胞膜損傷、不完整；胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，線粒體膨脹，嵴溶解、斷裂、消失；細(xì)胞核聚集，異染色質(zhì)增多。中藥組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間連接較緊密，線粒體無(wú)

2、明顯腫脹，嵴清晰，吞飲泡和溶酶體增多，胞質(zhì)偶見(jiàn)空泡。模型組血漿PAI1、ET比正常組增高，差異有顯著性（分別為P0.01，P0.05），中藥組與模型組比較，ET、PAI1降低（P0.05）；與正常組比較PAI1水平無(wú)顯著差異，ET增高（P0.05）。結(jié)論P(yáng)COS大鼠模型存在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)改變，血漿ET、PAI1升高，提示PCOS存在血瘀的微觀病理基礎(chǔ)?；钛鲋兴幠軌驈男螒B(tài)學(xué)上修復(fù)PCOS大鼠損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整內(nèi)皮細(xì)胞功能。 【關(guān)鍵詞】 多囊卵巢綜合征；動(dòng)物模型；活血化瘀；內(nèi)皮細(xì)胞Abstract： ObjectiveTo observe the effect of Chinese

3、herbs for activating blood stasis on the shape and function of the endothelial cells in rat aorta.MethodRat models of PCOS have been established according to Poresky, randomized into animal model and Chinese medicine group(TCM group)，normal rats were control group. Measure the serum level of FSH, LH

4、, T, INS and plasma ET PAI1, and observe the endothelial cell morph.Results In the model group,the endothelia cells of the aorta were contracted, with discontinuous basement membrane, inflated chondriosome, the middle layer smooth muscles tending to move inside and out of the normal shape of intraen

5、dothelial junction. In the TCM group, the endothelial cells appeared flat, arranging along the long axis of the blood vessels, normal endothelial cell integrity with scanty cytoplasm and the microscopic appearance shows highly developed golgiosome rough endoplasmic reticulum and smooth endoplasmic r

6、eticulum.The model group had a more increased serum level of PAII and ET than those of the control group, and showed the significant difference (P0.01，P0.05). The TCM group had a significantly lower serum level of PAII and ET than those of the model group(P0.05). There were no significant difference

7、s between the normal group and the TCM group on serum level of PAII (P>0.05). The TCM group had more decreased level of ET than those of the normal group(P0.05). Conclusion The morphologic changes of the endothelial cells and increase of ET and PAII were found in the PCOS model rat，indicating blo

8、od stasis was one pathogenesis of PCOS.Chinese herbs for activating blood stasis could morphologically repair damaged endothelial cells, regulate their functions.Key words: PCOS；animal model；activating blood stasis；endothelial cell根據(jù)臨床實(shí)踐多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者即使無(wú)血瘀證的外在征象，臨床上在辨證施治

9、的同時(shí)，適當(dāng)佐以活血化瘀之法，有助于提高療效，從而提高排卵率。根據(jù)“以方測(cè)證”的原則，推測(cè)PCOS存在血瘀的微觀病理改變。因此，本研究建立PCOS大鼠模型，觀察內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells cells，VEC）功能和形態(tài)變化及活血化瘀中藥對(duì)其影響，尋求活血化瘀中藥治療多囊卵巢綜合征的微觀證據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 SD雌性大鼠30只，SPF級(jí)，體重（200±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)20030001粵監(jiān)證字2005A031。胰島素注射液(沈陽(yáng)濟(jì)世制藥有限公司)、注射用人絨毛膜促性腺激素(HCG)(麗珠集

10、團(tuán)麗珠制藥廠)、FSH、LH、E2、T檢測(cè)試劑盒(羅氏診斷產(chǎn)品)、PAI1檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）、胰島素檢測(cè)試劑盒（河南省焦作市解放免疫診斷試劑研究所）、內(nèi)皮素檢測(cè)試劑盒（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所）?；钛龇剿帲ㄌ胰?2g，紅花10g，當(dāng)歸10g，熟地15g，川芎15g，赤芍15g，丹參15g），煎沸濃縮，制成2.5g/ml，4保存?zhèn)溆?。中藥飲片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物分組及處理 30只大鼠隨機(jī)分為正常組對(duì)照、模型組、中藥組，每組10只。每周稱(chēng)錄體重1次，每天進(jìn)行陰道涂片檢查。2周后，模型組依照Poretsky法1每只

11、動(dòng)物皮下注射HCG1.5IU，2次/d，共9d；胰島素注射液于第111d內(nèi)自0.5IU/d開(kāi)始，逐漸遞增至6.0IU/ d，并按此劑量維持至22d，以5葡萄糖溶液替代日常飲水中藥組給予中藥按25g/kg灌胃，每天9：00灌1次，連續(xù)21d。正常對(duì)照組每天注射等容積生理鹽水并灌胃給予等體積常水。末次給藥后禁食過(guò)夜，翌日動(dòng)物稱(chēng)重，乙醚麻醉后取眼眶靜脈血后，分離血清，置-20冰箱保存，待放射免疫測(cè)定FSH、LH、E2、T、ET、INS，酶免測(cè)定PAI1。1.2.2 卵巢組織觀察取其卵巢，去除卵巢表面的脂肪組織，10甲醛液固定，酒精逐級(jí)脫水，透風(fēng)，浸蠟包埋，5m切片，HE染色，光鏡觀察。1.2.3 內(nèi)

12、皮細(xì)胞觀察 3.4水合氯醛注入腹腔，將大鼠主動(dòng)脈從主動(dòng)脈根部至骼總動(dòng)脈分叉處取出，剝離外層結(jié)締組織，從腹側(cè)而縱行剝開(kāi)，生理鹽水沖洗干凈，2.5戊二醇初固定后，4冰箱中保存?zhèn)溆谩?.5戊二醇PBS固定液4 0C固定2h，PBS緩沖液4洗滌2次；再以1鋨酸PBS固定液40C固定2h、PBS緩沖液漂洗2次；70100梯度酒精、丙酮順序脫水；Epon812包埋劑常規(guī)電鏡包埋，LKBV型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾檸檬酸鉛雙重染色各10min，制備透射電鏡標(biāo)本，采用透射電鏡觀察并拍照。1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 體重變化處理

13、前各組體重差異無(wú)顯著性（P>0.05）。給藥后，模型組實(shí)驗(yàn)后體重比正常對(duì)照組體重明顯增加，差異有顯著性（P0.05）；中藥組低于模型組，但差異無(wú)顯著性（P>0.05）。2.2 陰道脫落細(xì)胞觀察 處理前各組動(dòng)物的陰道涂片均有明顯的性周期變化。約第10天左右完成HCG給藥后，模型組動(dòng)物陰道脫落細(xì)胞持續(xù)角化，性周期變化基本消失，其中7只大鼠呈典型間情期表現(xiàn)。正常對(duì)照動(dòng)物維持規(guī)律性的動(dòng)情周期，可見(jiàn)陰道分泌物拉絲現(xiàn)象。中藥組5只動(dòng)物維持規(guī)律性的動(dòng)情周期，2.3 卵巢形態(tài)學(xué)觀察2.3.1 卵巢大體解剖學(xué)改變 正常對(duì)照組卵巢色澤紅，表面多個(gè)紅點(diǎn)或紫點(diǎn)；模型組卵巢表面較蒼白，體積增大，見(jiàn)較多囊狀擴(kuò)

14、張的卵泡。中藥組部分（4/10）表面蒼白，部分表面見(jiàn)紅紫色斑點(diǎn)。2.3.2 卵巢光鏡檢查正常對(duì)照組見(jiàn)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞多為56層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡腔內(nèi)可見(jiàn)卵丘、卵細(xì)胞、放射冠、透明帶結(jié)構(gòu)。模型組囊性擴(kuò)張的卵泡增多，其卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少至12層，排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生明顯，卵泡膜層增厚，黃體組織數(shù)量明顯比正常對(duì)照組減少，有50(5/10)的卵巢未見(jiàn)黃體形成。中藥組60（6/10）的卵巢見(jiàn)黃體，黃體數(shù)量比模型組明顯增多，顆粒細(xì)胞多為46層，形態(tài)完整，排列整齊。2.4 內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡觀察 正常對(duì)照組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平完整，沿血管長(zhǎng)軸排列，

15、內(nèi)皮連續(xù)性完好，其相鄰內(nèi)皮細(xì)胞相互重疊呈緊密接合，內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)較少，內(nèi)皮細(xì)胞下連接緊密、間隙窄，內(nèi)皮細(xì)胞完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰（圖1）。模型組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞收縮，內(nèi)皮細(xì)胞間的連接失去正常形態(tài)，連接局部開(kāi)大，基底膜不連續(xù)，細(xì)胞膜損傷、不完整；胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，線粒體膨脹，嵴溶解、斷裂、消失；細(xì)胞核聚集，異染色質(zhì)增多（圖2）。中藥組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間連接較緊密，線粒體無(wú)明顯腫脹，嵴清晰，吞飲泡和溶酶體增多，胞質(zhì)偶見(jiàn)空泡（圖3）。2.5 血生化指標(biāo)比較2.5.1 血清FSH、LH、T、INS變化 模型組的血清LH、T、INS比正常對(duì)照組增高，差異有顯著性（P0.05），F(xiàn)SH降低

16、，但差異無(wú)顯著性（P>0.05）。中藥組與正常組比較，差異無(wú)顯著性（P>0.05）；與模型組比較LH明顯降低（P0.05），T、INS降低不明顯（P>0.05），F(xiàn)SH增高，但差異無(wú)顯著性（P>0.05，表1）。表1 血清內(nèi)分泌指標(biāo)比較（略）2.5.2 血漿PAI1、ET水平變化 模型組血漿PAI1、ET比正常對(duì)照組增高（分別為P0.01，P0.05）。中藥組與正常組比較，PAI1水平無(wú)顯著差異，ET增高（P0.05）；較模型組ET、PAI1降低（P0.05）（表2）。表2 血漿PAI1、ET水平變化（略）3 討論研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙可導(dǎo)致高血壓、糖尿病或糖耐量異常及血

17、脂紊亂等代謝性疾病發(fā)生和聚集，過(guò)量胰島素與細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子相互作用促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展2。內(nèi)皮功能障礙是胰島素抵抗綜合征的一個(gè)獨(dú)立組成部分3。ET是內(nèi)皮源性收縮因子中研究最多且被認(rèn)為是最強(qiáng)的血管收縮劑之一，是血管內(nèi)皮損傷性疾病的共同致病因子，被公認(rèn)為反映EC損傷的特異性首選指標(biāo)，目前尚未見(jiàn)ET與多囊卵巢綜合征關(guān)系的報(bào)道。PAI1是纖溶系統(tǒng)的重要組成成分，在血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放，是一個(gè)重要的獨(dú)立的心血管疾病危險(xiǎn)因素4，與IR密切相關(guān)。糾正胰島素抵抗導(dǎo)致的纖溶系統(tǒng)活性異常，也是預(yù)防IR合并心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。Glueck等6認(rèn)為，PCOS患者的各種癥狀可能與其血纖溶能力有關(guān)，PAI1的活性與P

18、COS患者的流產(chǎn)率呈正相關(guān)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)VEC損傷與血瘀證密切相關(guān)，活血化瘀藥物抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用是得到公認(rèn)的。趙建宏等7采用鹽酸腎上腺素制劑復(fù)制大鼠VEC損傷模型，觀察活血化瘀中藥（當(dāng)歸、紅花、川芎、丹參）對(duì)VEC功能的影響，結(jié)果表明：活血化瘀中藥能減少VEC損傷所致的脫落，增強(qiáng)VEC的抗凝、抗聚功能，具有良好的VEC保護(hù)作用。王青8報(bào)告血府逐瘀湯能明顯降低血瘀模型兔血漿ET的含量、升高PGI2的含量，并且可增強(qiáng)tPA活性，對(duì)PAI活性具有抑制作用，但對(duì)正常兔的以上指標(biāo)沒(méi)有影響，說(shuō)明血府逐瘀湯具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的作用。本研究表明PCOS大鼠模型存在內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，ET、P

19、AI1升高，說(shuō)明PCOS有血瘀的病理基礎(chǔ)，為臨床治療PCOS辨證基礎(chǔ)上輔以活血化瘀之法治療提供微觀依據(jù)?；钛鲋兴幙杉m正PCOS大鼠異常的內(nèi)分泌水平，降低PAI1、ET水平，修復(fù)受損傷的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，對(duì)防治并發(fā)癥有重要意義。【參考文獻(xiàn)】1Poresky L，Clemons J，Bogovich K. Hyperinsulinenia and human chorionic gonadotropin synergistically promote the growth of ovarian follicular cysts in ratsJ.Metabolism，1992，41(8)：903910.2朱族云，劉坤申.胰島素抵抗與內(nèi)皮細(xì)胞障礙團(tuán)J.國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè)，2002，22(9)：319320.3李秀鈞.胰島素抵抗綜