腫瘤標(biāo)志物ppt課件

1、P53蛋白是一種由蛋白是一種由393個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，位于細(xì)胞核。個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，位于細(xì)胞核。研究發(fā)現(xiàn)在癌旁正常和鱗狀化生的支氣管上皮未見(jiàn)研究發(fā)現(xiàn)在癌旁正常和鱗狀化生的支氣管上皮未見(jiàn)P53蛋白蛋白表達(dá)，表達(dá)，在輕在輕中中重度不典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌中，重度不典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌中，P53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率逐漸升高，表明蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率逐漸升高，表明P53基因與肺癌發(fā)基因與肺癌發(fā)生有關(guān)生有關(guān)對(duì)對(duì)P53基因的不同類(lèi)型腫瘤中突變頻率檢測(cè)結(jié)果，鱗癌為基因的不同類(lèi)型腫瘤中突變頻率檢測(cè)結(jié)果，鱗癌為63.6%，腺癌為，腺癌為65%，發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)P53蛋白在不同分化程度肺癌組織蛋白在不同分化程

2、度肺癌組織之間無(wú)顯著性差異，但之間無(wú)顯著性差異，但在肺鱗癌組織中隨分化程度降低在肺鱗癌組織中隨分化程度降低P53表達(dá)卻增強(qiáng)，認(rèn)為表達(dá)卻增強(qiáng)，認(rèn)為P53蛋白與肺鱗癌的關(guān)系可能較肺腺癌更蛋白與肺鱗癌的關(guān)系可能較肺腺癌更為密切為密切。而且在肺鱗癌伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，。而且在肺鱗癌伴有和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，P53表達(dá)無(wú)顯著性差異，而肺腺癌中伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)表達(dá)無(wú)顯著性差異，而肺腺癌中伴有與不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者移者P53表達(dá)具有顯著性差異，提示表達(dá)具有顯著性差異，提示P53過(guò)度表達(dá)與肺腺癌淋過(guò)度表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)P53蛋白蛋白鱗癌鱗癌P53細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞核陽(yáng)性1bcl

3、-2蛋白是原癌基因蛋白是原癌基因bcl-2編碼的一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡而不影編碼的一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡而不影響細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，響細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，1993年年P(guān)ezzella等研究等研究bcl-2在在NSCLC患者中的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)采用患者中的表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。該實(shí)驗(yàn)采用bcl-2特異性單特異性單克隆抗體及免疫組化染色測(cè)定克隆抗體及免疫組化染色測(cè)定80例肺鱗癌及例肺鱗癌及42例肺腺癌患者例肺腺癌患者腫瘤組織中腫瘤組織中bcl-2蛋白。結(jié)果蛋白。結(jié)果25%(20/80)的鱗癌患者及的鱗癌患者及12%(5/42)的腺癌患者的腺癌患者bcl-2蛋白陽(yáng)性蛋白陽(yáng)性，在鄰近的正常呼吸道上，在

4、鄰近的正常呼吸道上皮中，皮中，bcl-2蛋白僅存在于基底細(xì)胞。蛋白僅存在于基底細(xì)胞。bcl-2蛋白陽(yáng)性患者的蛋白陽(yáng)性患者的5年生存率高于陰性患者年生存率高于陰性患者(P0.1)，年齡為，年齡為60歲或歲或60歲以上歲以上bcl-2蛋白陽(yáng)性患者的預(yù)后最好蛋白陽(yáng)性患者的預(yù)后最好(P0.02)。該研究表明，原癌基因。該研究表明，原癌基因bcl-2在肺癌患者中發(fā)生異常表達(dá)，其表達(dá)與預(yù)后有一定關(guān)系在肺癌患者中發(fā)生異常表達(dá)，其表達(dá)與預(yù)后有一定關(guān)系原癌基因原癌基因bcl-2蛋白蛋白2腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用-標(biāo)志標(biāo)志 CEA ARP CA19-9 CA72-4 CA125 CA15-3 SC

5、C HCG 腫瘤腫瘤結(jié)腸結(jié)腸 胰腺胰腺 胃胃 食道食道 肝臟肝臟 膽囊膽囊 乳腺乳腺 卵巢卵巢 子宮頸子宮頸 絨毛膜絨毛膜 3腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物的組合應(yīng)用-標(biāo)志標(biāo)志 CEA ARP NSE SCC CYFRA21-1 HCG PSA TPA Calcitonin HTG 腫瘤腫瘤肺（肺（SCLC） 肺（肺（NSCLS） 胚胎細(xì)胞胚胎細(xì)胞 前列腺前列腺 膀胱膀胱 甲狀腺甲狀腺 C-細(xì)胞細(xì)胞 耳鼻咽喉耳鼻咽喉 4臨床檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物試驗(yàn)方法進(jìn)展臨床檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物試驗(yàn)方法進(jìn)展單相瓊脂擴(kuò)散法單相瓊脂擴(kuò)散法雙相瓊脂擴(kuò)散法雙相瓊脂擴(kuò)散法血凝法血凝法對(duì)流電泳法對(duì)流電泳法火箭電泳法火箭電泳法放射免疫

6、法放射免疫法（RIA）免疫放射法免疫放射法（IRMA） ELISA法法斑點(diǎn)法斑點(diǎn)法金標(biāo)法金標(biāo)法熒光免疫法熒光免疫法化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法（CLIA）電化學(xué)發(fā)光法電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）分子生物學(xué)分子生物學(xué)5雙相瓊脂擴(kuò)散法雙相瓊脂擴(kuò)散法單相瓊脂擴(kuò)散法單相瓊脂擴(kuò)散法抗體與凝膠混合抗體與凝膠混合后，裝于小玻璃管中，后，裝于小玻璃管中，待凝固后待凝固后加入抗原加入抗原溶液，使其擴(kuò)散入凝溶液，使其擴(kuò)散入凝膠與抗體反應(yīng)形成環(huán)狀乳白色沉淀帶膠與抗體反應(yīng)形成環(huán)狀乳白色沉淀帶 一種抗原或抗體混合物成分的定性與定量一種抗原或抗體混合物成分的定性與定量的分析方法的分析方法。通常采用。通常采用凝膠作為支持介質(zhì)凝膠作為

7、支持介質(zhì)，讓抗原與抗體混合物在介質(zhì)中互相擴(kuò)散，讓抗原與抗體混合物在介質(zhì)中互相擴(kuò)散，相 互 反 應(yīng) 形 成 沉 淀 弧 線(xiàn) 或 沉 淀 弧 帶相 互 反 應(yīng) 形 成 沉 淀 弧 線(xiàn) 或 沉 淀 弧 帶 6血凝法血凝法細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象稱(chēng)集，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象稱(chēng)為凝集反應(yīng)為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱(chēng)為。反應(yīng)中的抗原稱(chēng)為凝集原（凝集原（agglutinogen），抗體），抗體稱(chēng)為凝集素（稱(chēng)為凝集素（agglutinin）根據(jù)

8、凝集反應(yīng)的原理，以后又發(fā)根據(jù)凝集反應(yīng)的原理，以后又發(fā)展建立了，各種間接凝集試驗(yàn)、展建立了，各種間接凝集試驗(yàn)、間接凝集抑制試驗(yàn)以及固相免疫間接凝集抑制試驗(yàn)以及固相免疫吸附血凝試驗(yàn)等新方法吸附血凝試驗(yàn)等新方法7 膠乳微粒免疫檢測(cè)技術(shù)膠乳微粒免疫檢測(cè)技術(shù)是在膠乳凝集定性試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)是在膠乳凝集定性試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)展建立的展建立的-種非放射性均相免疫種非放射性均相免疫測(cè)定法，可以測(cè)定法，可以對(duì)各種微量的抗原對(duì)各種微量的抗原物質(zhì)和小分子半抗原物質(zhì)和小分子半抗原(加藥物、加藥物、團(tuán)體激素等團(tuán)體激素等)進(jìn)行精確的定量測(cè)進(jìn)行精確的定量測(cè)定定。根據(jù)特異性抗體致敏的膠乳。根據(jù)特異性抗體致敏的膠乳微粒微粒(一般為一般為

9、直徑約直徑約1m的聚苯的聚苯乙烯膠乳乙烯膠乳)，與待測(cè)標(biāo)本中的相，與待測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗原相遇時(shí)發(fā)生凝集反應(yīng)，膠應(yīng)抗原相遇時(shí)發(fā)生凝集反應(yīng)，膠乳凝集程度與被測(cè)物的濃度呈函乳凝集程度與被測(cè)物的濃度呈函數(shù)關(guān)系，由此可測(cè)出標(biāo)本中待測(cè)數(shù)關(guān)系，由此可測(cè)出標(biāo)本中待測(cè)物的含量。測(cè)定方法主要有粒子物的含量。測(cè)定方法主要有粒子計(jì)數(shù)法和濁度法兩種計(jì)數(shù)法和濁度法兩種 8 對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。在的緩沖液中，蛋白質(zhì)在的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極抗原帶負(fù)電荷向

10、正極泳動(dòng)泳動(dòng)；而；而抗體抗體大部分屬于大部分屬于Ig，由于分子量大，由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng) (電電滲是指在電場(chǎng)中液體對(duì)于一個(gè)固定固體的相滲是指在電場(chǎng)中液體對(duì)于一個(gè)固定固體的相對(duì)移動(dòng)。對(duì)移動(dòng)。瓊脂瓊脂是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液是一種酸性物質(zhì)，在堿性溶液中中帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷，而，而與它接觸的溶液帶正電荷，與它接觸的溶液帶正電荷，因此液體向負(fù)極泳動(dòng)因此液體向負(fù)極泳動(dòng)，產(chǎn)生電滲產(chǎn)生電滲) 在在抗原抗抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線(xiàn)體相遇的最適比例處形成乳白色沉

11、淀線(xiàn)。由。由于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)于電場(chǎng)的作用，限制了抗原、抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈散，而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡(jiǎn)便，僅敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作簡(jiǎn)便，僅需需3060分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高1015倍；但缺點(diǎn)是特異性倍；但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)散高不如雙向瓊脂擴(kuò)散高 9 火箭免疫電泳火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，RIEP)是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。電泳時(shí)，含合的一種定量檢測(cè)技術(shù)。電泳時(shí)，含于瓊脂

12、凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場(chǎng)的作用下促使樣品中的抗原向在電場(chǎng)的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與峰的高度與撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。因此，。因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時(shí)，以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可

13、準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品的沉淀峰長(zhǎng)度即可計(jì)算出待測(cè)抗原的含量；反之，當(dāng)瓊計(jì)算出待測(cè)抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測(cè)定待測(cè)脂中抗原濃度固定時(shí)，便可測(cè)定待測(cè)抗體的含量抗體的含量(即反向火箭免疫電泳即反向火箭免疫電泳) 10競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法雙抗體夾心法間接法間接法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1971年瑞典學(xué)者年瑞典學(xué)者Engvail和和Perlmannn,荷蘭學(xué)荷蘭學(xué)者者Van Weerman和和Schuurs分別報(bào)道將免疫技分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))。最

14、初發(fā)展的免疫。最初發(fā)展的免疫酶測(cè)定方法。是使酶與抗體或抗原結(jié)合，用以檢酶測(cè)定方法。是使酶與抗體或抗原結(jié)合，用以檢查組織中相應(yīng)的抗原或抗體的存在。后來(lái)發(fā)展為查組織中相應(yīng)的抗原或抗體的存在。后來(lái)發(fā)展為將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果結(jié)果。這種技術(shù)就是目前應(yīng)用最廣的酶聯(lián)免疫吸。這種技術(shù)就是目前應(yīng)用最廣的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，俗稱(chēng)附試驗(yàn)，俗稱(chēng)ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) 11 免疫印跡技術(shù)免疫印跡技術(shù)免疫印跡免疫印

15、跡(immunoblotting)又稱(chēng)又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，是一種是一種借助特異性抗體鑒定抗原的借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法有效方法。該法是在凝膠電泳和固。該法是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目一種新的免疫生化技術(shù)。將含有目標(biāo)蛋白標(biāo)蛋白(抗原抗原)的樣品首先用的樣品首先用SDS-聚聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或或非變性電泳非變性電泳(Native-PAGE)等分離等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然

16、后將纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)進(jìn)行特異性檢測(cè)12 免疫微粒技術(shù)免疫微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體抗原或抗體)，使其致敏，使其致敏為免疫微粒，用于免疫學(xué)及其他生物學(xué)檢測(cè)為免疫微粒，用于免疫學(xué)及其他生物學(xué)檢測(cè)與分離的一項(xiàng)技術(shù)。作為載體的微粒通常是與分離的一項(xiàng)技術(shù)。作為載體的微粒通常是以某種高分子有機(jī)單體為原料，經(jīng)過(guò)乳液聚以某種高分子有機(jī)單體為原料，經(jīng)

17、過(guò)乳液聚合、懸浮聚合及輻照聚合等高分子聚合方法合、懸浮聚合及輻照聚合等高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，微粒制備而成。由于制備材料及工藝不同，微粒的種類(lèi)繁多，現(xiàn)已制成的種類(lèi)繁多，現(xiàn)已制成惰性微粒惰性微粒如聚苯乙烯如聚苯乙烯膠乳微粒、膠乳微粒、活性微粒活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒磁性微粒及及標(biāo)記微粒標(biāo)記微粒(用同位素、熒光素或用同位素、熒光素或酶標(biāo)記酶標(biāo)記)等四大類(lèi)微粒，數(shù)量多達(dá)幾十種。等四大類(lèi)微粒，數(shù)量多達(dá)幾十種。將制備好的微粒與抗原將制備好的微粒與抗原(或抗體或抗體)經(jīng)物理吸附、經(jīng)物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)及生物素親合親橋聯(lián)法等致敏方法化學(xué)偶聯(lián)及生物素親合親

18、橋聯(lián)法等致敏方法形成免疫微粒。廣泛形成免疫微粒。廣泛應(yīng)用于各種可溶性大分應(yīng)用于各種可溶性大分子物質(zhì)的檢測(cè)、分離與純化、細(xì)胞標(biāo)記與識(shí)子物質(zhì)的檢測(cè)、分離與純化、細(xì)胞標(biāo)記與識(shí)別別等。近年來(lái)，等。近年來(lái)，微粒技術(shù)在核酸分子雜交、微粒技術(shù)在核酸分子雜交、DNA與與RNA的分離及的分離及PCR等研究領(lǐng)域等研究領(lǐng)域亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景 13 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是是采用熒光素標(biāo)記的已知抗采用熒光素標(biāo)記的已知抗體體(或抗原或抗原)作為探針，檢測(cè)待作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原原(或抗體或抗體)，形成的抗原抗體，形成的抗原抗體復(fù)合物

19、帶有熒光素，在熒光復(fù)合物帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受高壓汞燈顯微鏡下，由于受高壓汞燈光源的紫外光照射，熒光素光源的紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原以分辨出抗原(或抗體或抗體)的所在的所在位置及其性質(zhì)，并可利用熒位置及其性質(zhì)，并可利用熒光定量技術(shù)計(jì)算抗原的含量，光定量技術(shù)計(jì)算抗原的含量，以達(dá)到對(duì)抗原物質(zhì)定位、定以達(dá)到對(duì)抗原物質(zhì)定位、定性 和 定 量 測(cè) 定 的 目 的性 和 定 量 測(cè) 定 的 目 的14 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)又稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記又稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)新技術(shù)項(xiàng)新技術(shù)。把免疫反應(yīng)的特異性、組織。把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯化學(xué)的可見(jiàn)性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水